重組禽流感病毒(H5+H7)二價滅活疫苗對雞和鴨的免疫效果觀察

馮肖肖,吳赟竑,吳雪軍,華炯鋼,張 存,張 璐,何 杰,徐 輝

(1.浙江省動物疫病預防控制中心,浙江 杭州 311199;2.浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所,浙江 杭州 311199)

2013年2月開始我國上海、安徽、浙江等省市相繼出現了人感染H7N9流感的病例,并迅速傳播至其他省份,流行呈散發趨勢[1-5]。截止到2017年12月,我國已有人感染H7N9確診病例1 457例,死亡571例,死亡率為39.19%。H7N9亞型流感病毒屬于正粘病毒科甲型流感病毒屬,其基因組為8個節段的負鏈單股RNA病毒,在病毒增殖中極易發生變異[3-4]。2013年以來發現的H7N9流感病毒對禽類表現為低致病性,感染禽類后并無明顯臨床癥狀,并可以在禽類中持續擴散和傳播[4-5]。但是隨著病毒的變異和進化,2017年5月12日我國農業部首次報道了一起家禽H7N9流感疫情,該新型H7N9流感病毒HA蛋白的裂解位點發生了變異,呈現典型的高致病性禽流感分子特征,對禽類表現為高致病性,臨床癥狀與H5亞型高致病性禽流感類似,死亡率較高,對家禽養殖和人類健康造成極大威脅[8-9]。截止到目前,我國河南、天津、陜西、內蒙、黑龍江、安徽和河北等7個省份相繼發生了8起H7N9流感疫情,該疫情的快速傳播和流行已經給我國養禽業帶來嚴重的經濟損失,為防范家禽H7N9疫情風險,保障公共衛生安全,農業部決定從2017年9月起全面實施H7N9免疫。

為了解和評估重組禽流感病毒H5+H7二價滅活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)(簡稱H5+H7二價苗)免疫禽群后抗體變化情況和免疫效果,本次試驗選擇了H7抗體陰性的雞場和鴨場各1個,按照農業部高致病性禽流感免疫方案規定的免疫程序,開展了雞鴨現場免疫試驗,通過分析禽群免疫后的抗體效價和免疫合格率,評估H5+H7二價苗的免疫效果,從而為高致病性禽流感免疫方案制定提供可靠的理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 主要材料 14日齡雛雞和255日齡蛋雞由杭州余杭應田和蛋雞場提供,主要品種為仙居雞;14日齡雛鴨和288日齡蛋鴨由紹興咸亨紹鴨育種有限公司提供,主要品種為紹興麻鴨。重組禽流感H5+H7二價滅活疫苗(H5N1 Re-8株和H7N9 Re-1株)由農業部指定疫苗廠家哈爾濱維科生物技術開發公司生產,生產日期為2017002,有效期為201806。禽流感H5(Re-8株)HI抗原(批號抗原2016008/陽性血清2016001),H7N9 H7-Re1株流感HI抗原(批號2016002/陽性血清2015002),均來自哈爾濱維科生物技術開發公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋雞免疫抗體水平的測定 選取30只255日齡的蛋雞,按照農業部高致病性禽流感免疫方案規定的免疫程序,首次免疫后4周加強免疫1次,免疫劑量均為0.5 mL/只,在免疫后0周(255日齡)、1周(262日齡)、2周(269日齡)、3周(276日齡)、4周(283日齡)、5周(290日齡)、6周(297日齡)、7周(304日齡)和8周(311日齡)各采血進行抗體檢測,記錄并計算產蛋量。

1.2.2 雛雞免疫抗體水平的測定 100只孵化至14日齡的雛雞隨機分為A、B兩組進行免疫,按照農業部高致病性禽流感免疫方案規定的免疫程序,A組為“二次免疫組”,14日齡首次接種H5+H7二價滅活疫苗0.3 mL/只,35日齡二次免疫接種疫苗0.5 mL/只;B組為“一次免疫組”,只在14日齡接種1次疫苗0.3 mL/只。在免疫后0周(14日齡)、1周(21日齡)、2周(28日齡)、3周(35日齡)、4周(42日齡)、5周(49日齡)、8周(70日齡)和13周(105日齡)時分別隨機取30只采血進行抗體檢測。

1.2.3 蛋鴨免疫抗體水平的測定 選取30只288日齡的蛋鴨,按照農業部高致病性禽流感免疫方案規定的免疫程序,首次免疫后4周加強免疫1次,免疫劑量均為1.0 mL/只,在免疫后0周(288日齡)、1周(295日齡)、2周(302日齡)、3周(309日齡)、4周(316日齡)、5周(323日齡)、6周(330日齡)、7周(337日齡)和8周(344日齡)分別采血進行抗體檢測,記錄并計算產蛋量。

1.2.4 雛鴨免疫抗體水平的測定 100只14日齡的雛鴨分為A、B兩組進行免疫,按照農業部高致病性禽流感免疫方案規定的免疫程序,A組為“二次免疫組”,14日齡首次接種疫苗0.5 mL/只,35日齡二次免疫接種疫苗1.0 mL/只;B組為“1次免疫組”,只在14日齡接種一次疫苗0.5 mL/只。在免疫后0周(14日齡)、1周(21日齡)、2周(28日齡)、3周(35日齡)、4周(42日齡)、5周(49日齡)、8周(74日齡)和13周(100日齡)時分別隨機取30只采血進行抗體檢測。

1.2.5 抗體檢測 抗體檢測采用國家標準《高致病性禽流感診斷技術》(GB/T 18936—2003)中血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗方法,檢測同一份血清樣品的禽流感H5N1 Re-8亞型、H7N9 H7-Re1亞型禽流感抗體滴度水平。

2 結果與分析

2.1 蛋雞免疫重組禽流感H5+H7二價疫苗后的免疫抗體水平 255日齡蛋雞首次接種重組禽流感H5+H7二價疫苗,劑量為0.5 mL/只,并于一免后4周進行2次免疫,接種劑量為1.0 mL/只。免疫結果如圖1所示,蛋雞在免疫前其體內已有H5亞型抗體,平均效價達6.43 log2,免疫抗體合格率為100%。蛋雞H5亞型抗體水平在1免3周內逐漸上升并達到峰值10.7 log2,隨后1周有所回落;二免后5周內抗體水平始終維持在8.33～9.50 log2之間。同時,在蛋雞免疫周期內,H5亞型免疫抗體合格率始終為100%。

蛋雞在免疫前其體內無H7亞型抗體,一免后H7亞型抗體水平迅速上升,一免后2周和4周抗體效價分別達到了6.10 log2和8.30 log2;二免后H7抗體水平繼續上升,至二免后2周達到峰值10.13 log2,隨后有所下降,至第8周抗體效價為8.33 log2。同時,H7亞型免疫抗體合格率在一免后2周迅速上升至100%,免疫后2周～8周始終保持在100%。

以上結果顯示,蛋雞在免疫接種重組禽流感H5+H7二價疫苗二次后,H5亞型抗體水平因母源抗體影響而緩慢上升,H7亞型抗體水平迅速上升,至免疫后期兩者抗體水平變化趨勢相近,抗體滴度都在8 log2以上。因此,重組禽流感H5+H7二價疫苗在免疫蛋雞后可以快速達到穩定良好的H5和H7亞型免疫抗體水平及100%的免疫抗體合格率,具有良好的免疫效果。

圖1 蛋雞免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平

2.2 雛雞免疫重組禽流感H5+H7二價疫苗后的免疫抗體水平

2.2.1 雛雞一次免疫后的抗體水平 雛雞只在14日齡進行一次免疫接種,劑量為0.3 mL/只。免疫結果如圖2所示,免疫前雛雞體內的H5亞型母源抗體平均效價為2.53 log2,免疫抗體合格率為21.88%。免疫接種后1周母源抗體消失,H5亞型免疫抗體水平逐漸上升,第3周抗體水平即可達到5.37 log2,并在一免后4周達到峰值7.57 log2,隨后逐漸下降,第13周(105日齡)抗體平均效價為4.1 log2。同時,雛雞H5亞型免疫抗體合格率在免疫后3周達到合格(86.67%),第4周和第5周保持在100%,然后有所下降,至免疫后13周仍達到合格(80%)。

雛雞免疫前體內無H7亞型抗體,免疫接種1周后母源抗體消失,H7亞型抗體水平迅速上升,第2周和第3周抗體平均效價分別可達到4.17 log2和6.37 log2,至免疫后4周達到峰值7.43 log2,隨后逐漸下降,第13周抗體平均效價為3.87 log2。雛雞H7亞型免疫抗體合格率在免疫后2周達到合格(73.33%),第3周至第5周都維持在100%,隨后下降,第13周仍合格為83%。

以上結果顯示,雛雞免疫接種一次重組禽流感H5+H7二價疫苗后,第3周開始H5和H7亞型兩種免疫抗體合格率均在70%合格線以上波動,第4周達到最高水平,隨后逐漸下降,免疫8周以后抗體效價均低于6 log2。與蛋雞免疫后情況相似,免疫初期H7亞型抗體上升速率同樣快于H5亞型抗體,這可能是因為疫苗本身H7亞型抗原含量高于H5亞型引起的。這表明,重組禽流感H5+H7二價疫苗在免疫雛雞一次后可以提供一定的免疫保護效果,但是不能產生較高的抗體水平,免疫效果欠佳。

2.2.2 雛雞二次免疫后的抗體水平 雛雞在14日齡和35日齡分別進行劑量為0.3 mL/只和0.5 mL/只的免疫接種。免疫結果如圖3所示,在首免后3周進行二次免疫后,H5和H7亞型免疫抗體水平均繼續保持上升趨勢,至第5周達到峰值,抗體平均效價分別為9.10 log2和9.70 log2,隨后逐漸下降,第13周(105日齡)H5和H7抗體平均效價分別為7.60 log2和7.10 log2。同時,H5和H7亞型免疫抗體合格率在二免后均持續保持在100%。

以上結果顯示,雛雞免疫接種兩次重組禽流感H5+H7二價疫苗后,H5和H7亞型免疫抗體合格率分別在第4周和第3周達到100%,并隨后保持至第13周試驗結束。同時對比只免疫一次的雛雞組(圖4),雛雞二次免疫后各周H5和H7亞型抗體水平均進一步升高了2個滴度左右,并持續穩定在7 log2以上,在免疫后5周以后兩者存在極顯著差異(P＜0.01)。這表明,雛雞在免疫重組禽流感H5+H7二價疫苗兩次后,可以保證雛雞體內存在穩定持續的高抗體水平和100%的免疫抗體合格率,具有顯著的免疫保護效果。

圖3 雛雞二次免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平

圖4 雛雞免疫一次和兩次后免疫抗體水平差異比較

2.3 蛋鴨免疫重組禽流感H5+H7二價疫苗后的免疫抗體水平 288日齡蛋鴨首次接種重組禽流感H5+H7二價疫苗后4周進行二次免疫,接種劑量均為1.0 mL/只。免疫結果如圖5所示,免疫前蛋鴨體內H5亞型抗體平均效價為5.17 log2,免疫抗體合格率為86.67%。一免后H5亞型免疫抗體水平在2周迅速上升至9 log2以上,于第4周達到峰值9.73 log2;二免后H5抗體水平繼續維持在8.53～9.23 log2之間。同時,蛋鴨H5亞型免疫抗體合格率在免疫后2周即可達到100%,并持續維持至第8周。

免疫前蛋鴨體內并無H7亞型抗體,免疫后H7抗體水平快速上升,一免后2周即可達到7.43 log2,隨后保持穩定;二免后H7抗體水平進一步上升,于第6周達到峰值10.13 log2,隨后保持在9 log2左右的高水平。同樣的,蛋鴨H7亞型免疫抗體合格率在一免后2周迅速上升至100%并持續保持至第8周。

以上結果顯示,蛋鴨在免疫接種重組禽流感H5+H7二價疫苗后可以快速產生并持續保持高水平的H5和H7亞型免疫抗體和100%免疫抗體合格率,具有良好的免疫效果。

圖5 蛋鴨二次免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平

2.4 雛鴨免疫重組禽流感H5+H7二價疫苗后的免疫抗體水平

2.4.1 雛鴨1次免疫后的抗體水平 雛鴨只在14日齡進行一次免疫接種,劑量為0.5 mL/只。免疫結果如圖6所示,免疫前雛鴨體內的H5亞型母源抗體平均效價為0.83 log2,免疫抗體合格率為3.33%。免疫接種后1周母源抗體消失,H5亞型免疫抗體水平開始緩慢上升,并在免疫后4周達到峰值4.33 log2,隨后逐漸下降,至第13周(105日齡)抗體平均效價為1.77 log2。同時,雛鴨H5亞型免疫抗體合格率只有在免疫后4周才能達到70.00%,其余免疫周期內均處于合格線以下。

圖6 雛鴨一次免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平

雛鴨免疫前體內無H7亞型抗體,免疫接種后H7亞型免疫抗體水平迅速上升,第3周抗體效價達4.07 log2,并在一免后4周達到峰值5.63 log2,隨后迅速下降,第8周以后抗體效價下降為4 log2以下。H7亞型免疫抗體合格率在一免后4周才能達到合格(93.33%),隨后有所下降,第8周后下降為70%以下。

以上結果顯示,雛鴨免疫接種一次重組禽流感H5+H7二價疫苗后,大部分免疫周期內H5和H7亞型免疫抗體合格率均達不到70%的合格線,于第4周達到峰值后逐漸下降。盡管免疫初期H7亞型抗體上升速率和抗體效價均快于和高于H5亞型抗體,但免疫后各周抗體效價始終均低于6 log2。表明,重組禽流感H5+H7二價疫苗在免疫雛鴨一次后H5和H7亞型免疫抗體水平和合格率整體不高,免疫效果不理想。

2.4.2 雛鴨2次免疫后的抗體水平 雛鴨在14日齡和35日齡分別進行劑量為0.5 mL/只和1.0 mL/只的免疫接種。免疫結果如圖7所示,二次免疫后1周H5和H7亞型免疫抗體水平均迅速上升至峰值,效價分別為8.13 log2和9.16 log2,隨后開始逐漸下降,至第13周(105日齡)H5和H7抗體平均效價分別為4.93 log2和5.03 log2。同時,H5和H7亞型免疫抗體合格率在二免后均持續保持在70%以上。

以上結果顯示,雛鴨免疫接種兩次重組禽流感H5+H7二價疫苗后,H5和H7亞型免疫抗體合格率均在二免后保持70%以上。同時,比較雛鴨免疫一次和兩次后免疫抗體水平差異(圖8),雛鴨二次免疫后各周H5和H7亞型抗體水平均明顯比只一次免疫組的高3個滴度左右,二免后抗體平均效價均可維持在4.93 log2以上,在二免后1周以后兩者存在極顯著差異。表明,重組禽流感H5+H7二價疫苗在免疫雛鴨兩次后,免疫效果明顯要好于一次免疫效果,但弱于于雛雞和蛋雞組免疫效果。

圖7 雛鴨二次免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平

圖8 雛鴨免疫一次和兩次后免疫抗體水平差異比較

2.5 重組禽流感H5+H7二價疫苗免疫后的產蛋影響 臨床觀察結果顯示(圖9),除雞群一免后兩天飲水量有所增加外,雞群免疫后的采食飲水、精神狀態、糞便等都保持正常;鴨群免疫后采食量有所下降,1周后恢復正常,其余精神狀態和糞便等并無明顯變化。蛋雞的產蛋量在免疫前后未見明顯變化,只是在免疫接種、采樣后會出現短暫下降,之后2～3 d即恢復到正常水平。蛋鴨產蛋率在免疫前后有比較明顯,免疫接種后下降幅度大可達16% ～30%,二免后產蛋率逐漸穩定恢復正常水平。

圖9 蛋雞和蛋鴨免疫后產蛋率變化情況

3 討論

低致病性H7N9流感病毒一旦發生變異后對禽類表現為高致病性,2017年以來H7N9流感變異毒株給我國家禽養殖業帶來了嚴重的影響和損失[7-8]。國內外禽流感防控實踐措施表明,疫苗免疫是防治禽流感的關鍵措施之一[6,10-11]。因此,家禽H7N9流感的全面免疫是目前高致病性禽流感防控的重要措施,切實有效的保障全國禽類養殖業生產安全和公共衛生安全。通過蛋禽2次免疫的現場免疫試驗(一免后4周二免)及雛禽的1次和2次免疫(一免后3周二免)的現場免疫試驗,結果分析表明：(1)重組禽流感H5+H7二價疫苗對蛋雞和蛋鴨都具有良好的免疫效果,免疫后2周H5和H7亞型免疫抗體水平均能達到100%的免疫合格率,并能持續保持至二免后4周;(2)重組禽流感H5+H7二價疫苗對雛雞也具有較好的免疫效果,免疫一次時H5N1 Re-8和H7N9 Re-1抗體水平分別在一免后3周和2周達到70%以上的免疫合格率,并維持到一免后13周;進行二次免疫后,H5N1 Re-8和H7N9 Re-1抗體滴度明顯高于一次免疫,并維持在較高的抗體水平。其中,H5 Re-8相對于H7N9 Re-1抗體效價產生較慢的原因可能與雛雞母源抗體的影響有關;(3)重組禽流感H5+H7二價疫苗對雛鴨的免疫效果相對較差,H5N1 Re-8抗體水平在一次免疫周期內處于70%合格率以下,一次免疫效果不理想;二免后1周H5和H7亞型抗體水平均能達到80%以上的合格率。同時,雛鴨抗體水平和合格率均要明顯低于雞群免疫效果。兩者免疫后在H5和H7抗體水平上能夠相差0.37～3.74 log2和1.14～2.30 log2個滴度,H5和H7抗體合格率在一免后最高可相差了53和40個百分點,二免后最高相差了20和10個百分點。因此,雛鴨必須進行二次免疫才能達到滿意的免疫效果;(4)重組禽流感H5+H7二價疫苗免疫后對蛋禽產蛋率有一定程度的影響。蛋雞產蛋率下降較少且很快恢復正常水平,蛋鴨產蛋率變化顯著,恢復時間也較長,表明蛋鴨比蛋雞更易受到應激的影響。由于試驗需要蛋禽免疫后每周采集血樣測定抗體,免疫試驗中觀察到的蛋鴨產蛋影響時間較長與采血導致的應激反應極大相關。

因此,按照農業部推薦的免疫程序,對生長期少于70日齡的雞一次免疫,生長周期70日齡以上的肉雞和蛋鴨首次免疫后3～4周進行二次免疫,免疫后H5和H7亞型免疫抗體效價均可達到較高水平并維持較長時間,能滿足本省高致病性禽流感防控要求。而對生長周期少于70日齡的肉鴨在一次免疫后3周需要進行加強免疫才能保證免疫效果,為減少風險建議免疫2次以上。同時,在免疫接種蛋禽時要盡量減少接種應激帶來的產蛋率下降的影響,可采取開產前強化免疫、疫苗回溫注射、添加適量多種維生素等措施。另外,重組禽流感H5+H7二價疫苗中抗原含量因不同生產廠家和各批次間的差異可能會有所不同,從而造成免疫后H5和H7亞型免疫抗體水平差異。因此,免疫效果的持續監測是當前高致病性禽流感免疫防控工作中的重要環節。家禽免疫接種后及時進行抗體水平的免疫監測和效果評價,對禽群中出現免疫副反應、免疫抗體不達標、免疫失敗等情況要及時處理,進行補免或重免,以確保本省家禽高致病性禽流感的全面免疫效果。