清熱除濕止痛液的提取工藝研究

潘從澤 李喜香 董云霞 馮彥俊

基金項(xiàng)目：2015 年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2015468001）。

作者簡(jiǎn)介：潘從澤（1984-），男，漢族，碩士，中藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┑难芯俊-mail：pancongze@163.com

通信作者：

【摘 要】 目的：優(yōu)選清熱除濕止痛液的提取工藝。方法：以龍膽苦苷含量為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)來(lái)考察加水倍量、提取次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)龍膽苦苷的影響。結(jié)果：最佳提取工藝為加水量8倍，提取3次，每次提取50min。結(jié)論：優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定、可行、重復(fù)性好，可作為清熱除濕止痛液的提取工藝。

【關(guān)鍵詞】 龍膽苦苷;提取工藝;正交試驗(yàn)

【中圖分類號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）7-0024-03

Study on the Extraction Technology of Qingre Chushi Zhitong Ye

PAN Congze1 LI Xixiang1 DONG Yunxia2 FENG Yanjun1

1 Gansu Provincial Hospital Of TCM，Lanzhou 730050，China;2 Pulmonary Hospital Of Lanzhou，Lanzhou 730050，China

Abstract：Objective To optimize the extraction process of Qingre Chushi Zhitong Ye. Methods Taking the content of gentiopicroside as the index，the L9 （34） orthogonal test was used to investigate the effect of water addition， extraction times and extraction time on Gentiopicroside. Results The best extraction process is 8 times of water addition， 3 times of extraction， 50 minutes each time. Conclusion The preferred extraction process is stable，feasible，and reproducible，and can be used as an extraction process for Qingre Chushi Zhitong Ye .

Keywords：Gentiopicroside;Extraction Process;Orthogonal Test

清熱除濕止痛液是甘肅省中醫(yī)院協(xié)定處方制劑，由秦艽、忍冬藤、防己等十味中藥組成，具有清熱除濕，通絡(luò)止痛的功效，用于治療風(fēng)濕性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，強(qiáng)直性脊柱炎、肩周炎、頸椎病等屬風(fēng)濕熱痹、出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛，局部紅腫灼熱等癥。歷經(jīng)多年臨床應(yīng)用效果明顯，可顯著改善風(fēng)濕熱痹型膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限、局部腫脹，發(fā)熱等局部和全身癥狀[1]。現(xiàn)擬將傳統(tǒng)湯劑改為便于服用的合劑，對(duì)其提取工藝進(jìn)行研究，轉(zhuǎn)化為醫(yī)院制劑，更好的為臨床服務(wù)。方藥中秦艽為祛風(fēng)濕熱藥，指標(biāo)成分為龍膽苦苷，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎等作用[2-4]。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)，以龍膽苦苷為評(píng)判指標(biāo)，對(duì)清熱除濕止痛液進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，找到最佳提取條件，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)有一定指導(dǎo)意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695型HPLC儀，Waters 2998型光電二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）;ABT100-5M電子天平（KERN德國(guó)）;MH-5000型可調(diào)式電熱套（武漢格萊莫檢測(cè)設(shè)備有限公司）;AKRY-UP-1816超純化水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）;RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;SB-5200DTR超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料 秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材均購(gòu)于蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院李喜香主任中藥師鑒定，符合2015版《中國(guó)藥典》藥材項(xiàng)下規(guī)定;龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)110770-201716，中國(guó)食品藥品檢定研究院），甲醇為色譜純（批號(hào)20171204，天津市福晨化學(xué)試劑廠），其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定[4-7]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symm-etry-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇：水=30∶[KG-*3/5]70;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm;柱溫：25 ℃。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以龍膽苦苷峰計(jì)應(yīng)不少于4000，分離度>1.5，龍膽苦苷對(duì)照品、清熱除濕止痛液供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品1.08 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取9份含秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材的混合飲片（78 g），按擬定的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行水煎煮提取，濾過(guò)后濃縮至適量，加入乙醇，使含醇量達(dá)55%，靜置16小時(shí)，抽取上清液，回收乙醇至無(wú)醇味，加純化水至100 mL，得到清熱除濕止痛液。精密量取10 mL清熱除止痛液置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，微孔濾膜濾過(guò)，濾液即為供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 按清熱除濕止痛液處方和制備工藝制備缺秦艽的陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.1.5 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件依次進(jìn)樣，以進(jìn)樣量（μL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程為：y=1727.83438x+15.00419，r=0.99994（n=5）線性范圍：0.52～4.16μg。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.24%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.3” 項(xiàng)下供試品溶液10μL，分別與放置在0、2、6、10、14、24h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.39%（n=6），表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按處方比例稱取處方藥材78g，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷峰面積的RSD為1.71%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 按處方比例稱取秦艽、忍冬藤、防己等十味藥材混合飲片39 g，平行9份，平均分為3組，每組分別按清熱除濕止痛液中龍膽苦苷含量的80%，100%，120%精密加入龍膽苦苷對(duì)照品，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共9份，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為99.48%，RSD=1.67%（n=9），表明該方法可行。結(jié)果見表1。

2.2 正交試驗(yàn) 以提取時(shí)間（A）、加水倍量（B）、空白（C）及提取次數(shù)（D）為考察因素[8-9]，以龍膽苦苷含量為指標(biāo)，按正交L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果和方差分析分別見表2、表3和表4。

由極差分析結(jié)果可以得出，各因素對(duì)龍膽苦苷含量影響的大小順序?yàn)椋?A（提取時(shí)間）>B（加水倍量）>D（提取次數(shù)），其最佳工藝為A2B1D2。

由方差分析結(jié)果可知，提取時(shí)間（A）和加水倍量（B）差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而提取次數(shù)（D）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。考慮到藥材的提取效果，確定提取次數(shù)為3倍，得出最佳提取工藝為A2B1D3，即加水量8倍，提取3次，每次提取50min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照最佳提取工藝A2B1D3分別提取三批處方量藥材進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，按照“2.1.3” 項(xiàng)下方法測(cè)定龍膽苦苷的含量，取平均值，結(jié)果優(yōu)于或近似于正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。驗(yàn)證結(jié)果見表5。

3 討論

清熱除濕止痛液是由秦艽、忍冬藤、絡(luò)石藤、桑寄生、薏苡仁等10味中藥制成的復(fù)方制劑，其中秦艽為君藥，傳統(tǒng)用于風(fēng)濕痹痛、筋脈拘攣、骨節(jié)酸痛等病癥，廣泛用于風(fēng)濕病的治療，在本院治療膝骨關(guān)節(jié)炎疾病的眾多案例中，取得了良好的臨床效果[1]。秦艽藥材中的主要成分以龍膽苦苷為主的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物，而龍膽苦苷為其指標(biāo)性成分[10]，選其為含量測(cè)定指標(biāo)，且對(duì)清熱除止痛液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步研究有一定的參考作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)清熱除濕止痛液提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，通過(guò)測(cè)定龍膽苦苷的含量來(lái)評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量，確定了最佳的提取工藝為加水量8倍，提取3次，每次提取50min，適合實(shí)際生產(chǎn)，可作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)和參考。

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（收稿日期：2019-02-13 編輯：程鵬飛）