鋁鹽雙波長比色法測定冬青葉中的總黃酮含量

李汪洋 劉鑫 李國明 全若琳 楊海嬌 李貴 魏華 張曉蓉

摘 要 通過超聲波輔助提取冬青葉總黃酮，構建了鋁鹽雙波長比色法檢測總黃酮模型，優化了冬青葉總黃酮的測定方法，其測定波長為510 nm，參比波長為450 nm，在0.00～39.29 μg·mL-1時可用于測定冬青總黃酮，擬合的蘆丁標準曲線方程為Y=0.017X-0.000 8，R2=0.999 3。通過該方法測定冬青葉中總黃酮的含量為2.21%～2.55%（n=6）。鋁鹽雙波長比色法可用于快捷簡便地測定冬青葉中的總黃酮含量。

關鍵詞 冬青;總黃酮;含量測定;鋁鹽雙波長比色法

中圖分類號：R284.1 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.06.067

冬青（Ilex chinensis Sims）為冬青科Aquifoliaceae冬青屬Ilex多年生植物，我國主產于安徽省、江西省、浙江省、兩湖兩廣等江南各省，一般生長于海拔500～1 000 m

的山坡常綠闊葉林中和林緣地帶。冬青屬植物多用于清熱解毒、消炎、鎮咳祛痰及治療心血管疾病。冬青的根、種子、樹皮均可入藥，其葉有清熱利濕、消腫鎮痛之功效，用于肺炎、急性咽喉炎癥、痢疾、膽道感染、外治燒傷、下肢潰瘍、皮炎濕疹、腳手皮裂等[1-3]。現代醫學研究表明，黃酮類是冬青主要活性成分之一，其具有明顯的降壓降脂、抗菌消炎及抗腫瘤等藥理功能。在對冬青葉中總黃酮含量進行測定時，發現其直接測定結果偏高;與文獻報道冬青葉總黃酮的含量存在較大差異（一般<3%）。基于此，擬采用雙波長等方法對冬青葉中總黃酮含量測定體系進行研究，以優化和改進總黃酮含量測定體系。

1 材料與方法

實驗儀器主要有超純水制備系統（P20-Y，長沙源科儀），電子天平（1/100 000，AG285，METTLE TOLEDO），紫外可見分光光度儀（UV2550，島津），超聲波提取器（昆山市超聲提取有限公司），萬能高速粉碎機（天津市斯泰勒儀器有限公司）。實驗試劑包括蘆丁標準樣品（融禾公司生產）及以下為分析純試劑：乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉;實驗用水為超純水。實驗材料冬青葉于60 ℃恒溫干燥，粉碎，過70目篩，裝袋備用。

實驗方法主要參考劉亞倩等[4-6]研究者進行蘆丁標準曲線的制備、冬青總黃酮供試品溶液的提取富集、總黃酮含量的檢測等步驟，并在此基礎上改進冬青葉總黃酮檢測方法。具體步驟如下。

1.1 標準曲線的制備

準確移取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、15.0 mL的0.2 mg·mL-1蘆丁標準溶液，分別置于50 mL比色管中，加1.50 mL5.0%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置11 min，加入1.50 mL10.0%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置12 min后加入10 mL4.0%氫氧化鈉溶液，搖勻，靜置20 min，于510 nm及參比波長450 nm處測定其吸光值，記錄下不同濃度吸光值。運用Excel等軟件，以濃度為X軸，吸光值差值為Y軸繪制標準曲線方程Y=0.017X-0.000 8，Y吸光度，X為濃度，R2=0.999 3，在（0，39.29]μg·mL-1檢測范圍內符合該方程

1.2 供試品溶液的制備

準確稱取0.250 g冬青樣品于50 mL容量瓶中，用60%乙醇20 mL超聲提取30 min后取出定容，過濾，濾液即為待測供試品溶液。

1.3 總黃酮含量測定

移取10 mL待測供試品溶液于50 mL比色管中，加入10 mL去離子水，搖勻，加入1.5 mL5%的亞硝酸鈉，搖勻，靜置11 min，加入1.5 mL10%硝酸鋁，搖勻，靜置12 min后再加入10 mL4%氫氧化鈉溶液，搖勻靜置20 min后在510 nm及參比波長處測定其吸光度，根據差值建立標準曲線并計算總黃酮濃度然后進一步計算總黃酮含量。計算公式：

式中，W為總黃酮含量（%），C為總黃酮濃度（μg·mL-1），V2為稀釋定容體積（mL），V1為取樣體積（mL），V0為提取液總體積（mL），M為供試樣品質量（g），兩個1 000分別表示μg到mg及mg到g的換算系數，100則表示100 g樣品中總黃酮的含量。

1.4 改進樣品測定方法

樣品測定方法包括供試樣品溶液的全波長掃描、篩選和建立雙波長檢測模型及驗證擬合檢測結果等。以下是操作步驟。1）供試樣品溶液的全波長掃描。分別吸取之前備好的供試品溶液在比色皿中，潤洗1～3次后加入比色皿中，利用紫外分光光度儀在檢測波長510 nm和參比波長450 nm處進行測定并分別記錄下其吸光度。2）篩選和建立雙波長檢測模型。通過全波長掃描圖譜，分析其供試樣品的峰值及可能存在干擾的峰谷值，并通過△OD來篩選和建立雙波長檢測模型。其中，△OD=OD510 nm-OD450 nm，通過扣除干擾，從而對檢測項目進行測定和計算。3）驗證擬合檢測結果。通過測定6份不同批次供試材料樣品，對擬合檢測結果進行統計，初步驗證和評價擬合模型的科學性程度。

2 結果與分析

經過對各個供試樣品的全波長掃描結果進行解析，發現其總黃酮掃描的峰值出現在（500±4）nm，而（450±4）nm處存在一峰谷值，與主峰OD500 nm的峰值存在明顯疊加。分析表明這種吸光值的疊加，極有可能是造成冬青總黃酮含量測定干擾的主因。經過△OD（OD500 nm-OD450 nm）雙波長擬合扣除干擾后，測定6份冬青葉供試材料的總黃酮含量，其總黃酮的含量最低為2.24%，最高為2.60%，6份樣本的平均值為2.21%～2.55%。

在課題組預實驗時發現，通過鋁鹽單波長比色法測得冬青葉總黃酮含量高于文獻中報道（其總黃酮均低于3%）1倍以上，可能是冬青葉中的其他成分在總黃酮的檢測中，由吸光度疊加引起的。而通過△OD（OD500 nm-OD450 nm）雙波長擬合扣除干擾后，能夠較好地測定冬青葉中總黃酮的含量，初步表明該雙波長檢測方法適用于檢測冬青葉中的總黃酮含量[7]。

3 結語

冬青葉總黃酮測定中的雜質消除、總黃酮中主要黃酮類物質的提取工藝及高純度冬青葉中的黃酮類單體的制備也是后續研究工作的一部分。冬青葉中總黃酮測定的鋁鹽雙波長比色法，實現了冬青葉中總黃酮含量的科學、快捷檢測，為冬青葉中總黃酮資源的研究和開發提供了理論基礎和實踐參考。

參考文獻：

[1] 中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1999.

[2] 俞祥生，王強.冬青屬植物葉成分分析[J].中國藥科大學學報，1992，6（2）：26-28.

[3] 陳衛琳，程再興，陳紅，等.正交設計優選毛冬青總黃酮提取工藝[J].遼寧中醫藥大學學報，2011，13（10）：62-63.

[4] 田建平，李娟玲，胡遠艷，等.冬青屬苦丁茶葉總黃酮含量測定與資源評價[J].食品科技，2014，39（1）：278-281.

[5] 劉亞倩，魏華，李貴，等.薺菜總黃酮質量分數測定及超聲波提取工藝優化[J].吉首大學學報，2016，37（1）：74-79.

[6] 張蘭杰，辛廣，張維華.雙波長分光光度法測定黑玉米花粉中總黃酮的含量[J].食品科學，2006，27（2）：230-232.

[7] 劉謹，丁平.冬青屬藥用植物資源、化學成分及藥理作用研究進展[J].廣州中醫藥大學學報，2008，25（3）：277-280.

（責任編輯：劉昀）