MDCK細胞連續傳代培養的生長特性研究

竇曉霞，馬桂蘭，喬自林，王家敏，李 倬*

（1.西北民族大學生物醫學研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術有限公司，甘肅 蘭州 730010；3.甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州 730030）

MDCK細胞系是從美國一頭母曲架犬的腎臟組織分離培養獲得的細胞系，通常該細胞呈上皮樣以貼壁方式生長，可連續傳代培養。許多研究表明MDCK細胞系可廣泛用于多種病毒的擴增和純化，尤其是對流感病毒的感染效率高、增殖快，且流感病毒不易變異的優點，是目前被公認的最適合流感疫苗生產的細胞系之一[1-4]。傳統的流感（禽流感）疫苗是由雞胚來繁殖病毒的，該技術雖然非常成熟，但它在疫苗需求激增時會出現生產能力不足的問題，特別是在應對流感大流行時或暴發禽流感疫情時連雞胚供應也存在困難，1995年，WHO就曾推薦使用傳代細胞來生產流感疫苗。近幾年，圍繞MDCK細胞系替代雞胚用于流感及禽流感病毒的監測、研究及疫苗生產的研究均有了突破，為細胞基質的新型流感疫苗的開發提供了理論和實踐支持，MDCK細胞為基質的流感（禽流感）疫苗是大勢所趨[5-8]，我國各級政府也很支持基于MDCK細胞的流感（禽流感）疫苗的研究和生產。作者所在單位甘肅省動物細胞工程技術研究中心（西北民族大學）于2014年從ATCC引進了MDCK標準細胞系，擴大培養凍存后進行了復蘇和傳代培養實驗，確定了引進的細胞凍存復蘇效果良好，連續傳代培養10代生長特性基本穩定，可用于相關課題的研究。

1 材料與方法

1.1 MDCK細胞

（ATCC引進，CCL-34TM，批號：60245139。引進時細胞代次為55代，培養一代后凍存）；DMEM（高糖，Gibco，貨號：02-5062EJ，批號：1490890，由蘭州百靈生物技術有限公司配制成液體，配制批號：20140719，滲透壓319mOsmol/kg）；胎牛血清（FBS，蘭州民海生物工程有限公司生產，批號20140417）；胰蛋白酶（Gibco，貨號：27250，蘭州百靈生物技術有限公司配制成0.25%胰蛋白酶溶液，配制批號：20140425，含EDTA-Na 0.3g/L）；顯微鏡（OLYMPUS，CKX-41）；CO2培養箱（ThermoFisher，3111）等。

1.2 細胞復蘇及活力測定

按常規方法復蘇MDCK細胞（P56），檢查細胞活力達到90%以上時，用10%FBS（體積百分比，下同）的DMEM培養基培養（37℃、5%CO2，下同）。

1.3 連續傳代培養

待細胞生長至90%以上融合時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1:4比例分瓶培養，連續傳代10代（P66）。

1.4 細胞生長曲線繪制

在P57、P59、P62和P66代繪制細胞生長曲線。

1.4.1 細胞懸液的制備 取長成單層的待測細胞，用常規細胞消化方法進行消化，制成細胞懸液，計數。

1.4.2 稀釋 根據計數結果，按有限稀釋法的原則，將細胞懸液稀釋至1×104個/ml。

1.4.3 接種及培養 將稀釋好的細胞懸液接種到24孔細胞培養板培養，每孔1 ml。

1.4.4 計數及活力檢查 從接種培養起，每隔24 h，分別消化3孔的細胞進行計數。

1.4.5 生長曲線繪制 以培養時間為橫坐標，細胞密度為縱坐標，繪制細胞的生長曲線圖。

1.5 細胞倍增時間計算

取細胞增長峰值前一次（96 h）所計得的細胞總數(Y)，接種細胞數（X）及生長時間（T）計算：倍增時間=T/A （式中：A=log2Y/X）。

1.6 細胞最大增殖濃度

細胞生長曲線的峰值即為細胞最大增殖濃度，P57代細胞在144 h細胞密度還未見降低，統計時按144 h的細胞密度為最大增殖濃度。

2 結果

凍存的MDCK復蘇活力為95.3%。MDCK細胞復蘇后第一代培養細胞生長較慢，可能細胞剛復活有適應的過程，傳代一次后生長變快，按1:4分瓶子比例培養時，在48h就形成較致密單層，連續傳代培養10代細胞形態基本一致，如圖1。

圖1.MDCK細胞形態圖(48h,10X)（a.P57,b.P59,c.P62,d.P66）

P57生長曲線在48-144 h近直線，144 h細胞密度為107.6×104個/ml，還未出現下降的情況，倍增時間為15.8 h。P59、P62和P66細胞生長曲線成近“S”曲線，最達峰值均出現在120 h，分別105.5×104、97×104和102.4×104（個/ml），倍增時間分別為15、15.2和15.3（h），見圖2。

圖2.MDCK細胞生長曲線圖

3 結論

隨著生物制藥的快速發展，對生產用細胞系的要求越來越嚴格，標準細胞庫建設就顯得尤其重要。ATCC是全球規模最大管理最規范和最有權威的細胞保藏機構之一，為全世界的科研工作有償許可的提供標準細胞株。每次從國外引進細胞株的成本很高，引進后首要的工作就是要進行保種，為后期工作提供最原始的細胞種子。作者所在單位于2014年從ATCC引進了MDCK細胞系，通過復蘇和連續傳代驗證了保種的效果，初步證實了引進和保種的細胞是可靠的。當然， 確定一株細胞能否用于疫苗方面的研究，還要建立可持續使用數量足以維持數年或數十年工作所需的主細胞庫和工作細胞庫，生產用的還要確定超高代次，要進行更全面的細胞檢定，有的甚至送第三方機構進行，檢定的內容主要包括遺傳特征、外源因子污染和致瘤性等方面，隨著研究工作的深入開展，這也是今后工作的重點。[9]