基質金屬蛋白酶及抑制劑在伴有神經周浸潤的胰腺癌組織中的表達＊

陳瑾歆，莫 琳，王含彥

胰腺癌起病隱匿，發展迅速，手術切除率低，術后復發率高，預后極差，是嚴重危害人類健康的惡性疾病之一［1］。 神經周浸潤（perineural invasion，PNI）是胰腺癌的一項病理學特征［2］，廣義的PNI是指腫瘤細胞包繞神經表面或浸潤神經外膜或進入神經束膜以內［3］，被認為是胰腺癌轉移、局部復發的一種方式［2］。有研究報道胰腺癌PNI發生率與患者的手術切除率、術后復發率和平均生存期直接相關［4］。因此研究有神經周浸潤的胰腺癌特異表達的基因對胰腺癌的早期診斷、手術選擇和術后干預有重要意義。

該研究通過觀察基質金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinases，MMPs）和組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）在有神經周浸潤的胰腺癌組織和癌旁組織中的表達，探討基質金屬蛋白酶和金屬蛋白酶的組織抑制劑在胰腺癌發生、發展和早期轉移中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料胰腺癌癌旁組織和腫瘤組織從川北醫學 院 附 屬 醫 院 獲 得 ；TRIZOL （Invitrigon）；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）；SYBR Green PCR Kit（QIAGEN）；全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物有限公司）；BCA Protein Assay Kit（Thermo，23227）；PAGE 凝膠制備試劑盒（Promoton，PG112）；一抗：抗 MMP-2、MMP-9、TIMP-2、GAPDH抗體（CST，USA）；熒光標記羊抗兔二抗（KPL，USA）。

1.2方 法

1.2.1 分組 實驗分為癌旁對照組、有神經周浸潤的胰腺癌組。

1.2.2 組織形態學觀察 取22例胰腺癌患者癌旁組織和腫瘤組織HE染色鑒定有無神經周浸潤，將檢測有神經周浸潤的胰腺癌組織和癌旁對照組織用預冷的PBS洗3遍，液氮保存備用。

1.2.3 RT-qPCR 將有神經周浸潤的胰腺癌組織和癌旁組織碾細，加入TRIZOL裂解液，按說明書方法提取總RNA，NanoDrop 2000微量分光光度計檢測RNA含量與純度，采用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對RNA完整性進行鑒定。根據260 nm光吸收值計算總RNA的濃度，以OD260/OD280確定純度。用約 1.5 μg總 RNA 為模板，采用試劑盒（Takara）提供的方法去除基因組DNA污染，合成cDNA。用合成cDNA進行在實時定量檢測擴增儀上擴增模板并檢測熒光，qPCR 反應體系為 20 μl：SYBY qPCR mix 10.0 μl，特異上下游引物（10 pmol/μl）各 1 μl，cDNA模板 2.0 μl，去離子水補足 20 μl。 熒光定量 PCR 反應條件：95℃ 變性 2 min；95 ℃ 30 s，60℃ 1 min 30 s，72℃30 s擴增40個循環，在每個循環60℃延伸時檢測熒光，循環完成后做融解曲線。所有目的基因和內參照GAPDH的反應體系和反應條件相同。用于qPCR反應的特異引物序列如下：MMP2-F：GGAATGAAGCACAGCAGGTCTCAG，MMP2-R：AG CCAAGCGGTCTAAGTCCAGAG；MMP9-F：TCCTGG TGCTCCTGGTGCTG，MMP9-R：CTGCCTGTCGGTG AGATTGGTTC；TIMP-2-F：TGCAGGAGGAATCGG TGAGGTC，TIMP-2-R：GAACAGGCAAGAAGCAAT GGCAAC；GAPDH-F：ATTGACCTCAACTACATGGT TTACATG，GAPDH-R：TTGGAGGGATCTCGCTCCT GGAAG（擎科生物）。根據待測cDNA中目的基因和GAPDH的Ct值，用相對定量的方法以每個樣品的目的基因 2-△△（Ct1-Ct2）作為目的基因的表達水平。

1.2.4 Western印跡試驗 將有神經周浸潤的胰腺癌組織和癌旁組織碾細，加入細胞裂解液冰上裂解30 min，離心10 min取上清收集細胞總蛋白，經BCA法分析定量調整蛋白濃度一致，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃變性5 min。變性的蛋白樣品經10%SDS-PAGE電泳 （MMP-2和MMP-9） 及12%SDS-PAGE電泳（TIMP-2）分離，電轉移至 PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入一抗：MMP-2（1∶1000）、MMP-9（1∶1000）、TIMP-2（1∶1000）、GAPDH（1∶2000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，加熒光標記二抗 （1∶10000） 室溫孵育 1 h，TBST 洗膜，ODYSSEY雙色紅外激光成像系統掃膜成像。目的蛋白的表達水平以圖像目的蛋白與GAPDH的灰度比表示，比值越大，目的蛋白的表達水平越高。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件，數據以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 有神經周浸潤的胰腺癌組織的鑒定取臨床胰腺腫瘤病理組織做HE染色鑒定有神經周浸潤的胰腺癌組織（圖1，見封三）。

圖1見封三。

2.2 q PCR檢測癌旁對照組織和腫瘤組織中MMP-2、MMP-9和TIMP-2 mRNA的表達與癌旁組織比較，有神經周浸潤的胰腺癌組織MMP-2（P＜0.05）、MMP-9（P＜0.01）和 TIMP-2（P＜0.01）mRNA的表達均顯著增加（圖2）。

圖 2 胰腺癌癌旁組織和腫瘤組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-2 mRNA 的表達

2.3 免疫印跡檢測癌旁對照組織和腫瘤組織中MMP-2、MMP-9和TIMP-2的表達與癌旁組織相比，有神經周浸潤的胰腺癌組織MMP-9（P＜0.05）和 TIMP-2（P＜0.01）的表達顯著增加；MMP-2在癌旁組織和腫瘤組織中的表達無明顯差異 （P＞0.05）。見圖 3。

3 討論

神經周浸潤（PNI）是胰腺癌預后的獨立指標，是胰腺癌根治術后局部復發、腹膜后蔓延和出現頑固性疼痛的主要原因之一［5］。PNI的分子機制尚不清楚，目前認為可能是生長因子、細胞因子、蛋白酶、激素和微環境等多種因素誘導腫瘤細胞游走，侵襲神經組織［6］。

圖 3 胰腺癌癌旁組織和腫瘤組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-2 蛋白的表達

MMPs和TIMPs與惡性腫瘤的侵襲和轉移密切相關［7］。基質金屬蛋白酶（MMPs）是一類金屬依賴性的內源性蛋白水解酶［8］，可降解細胞外基質（Extracellular Matrix Proteins，ECM）、調節細胞黏附、促進血管新生，在組織的修復及腫瘤細胞的浸潤轉移等生理和病理過程中具有重要作用［9］。目前已知MMPs有 20多種， 如 MMP1、MMP2、MMP9和MMP11等。組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是MMPs的抑制劑，對MMPs的功能具有調節作用［10］。TIMPs可與無活性（酶原）及活化的MMPs形成緊密穩定的復合體，阻斷MMPs與底物結合，抑制其活性，在ECM改建、腫瘤的侵襲轉移等生理、病理過程中發揮重要作用。正常情況下，體內的MMPs與TIMPs保持相對平衡，惡性腫瘤常伴有MMPs活性增強或TIMPs活性降低，如MMP-2和MMP-9在多種腫瘤中高表達［11］，MMP-2和 MMP-9可降解血管基底膜主要成分——Ⅳ型膠原，使腫瘤細胞能突破基底膜屏障，發生浸潤和血行轉移［12，13］。 TIMP-2 是 MMP-2 的特異性抑制劑，活性增強可抑制MMP-2的活性，抑制癌細胞轉移及侵襲［14］。

在該研究中，采用胰腺癌病理組織，檢測了基質金屬蛋白酶MMP2/MMP9和組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2在有神經周浸潤的胰腺癌組織中mRNA和總蛋白的表達。結果顯示，與癌旁組織比較，有神經周浸潤的胰腺癌組織MMP-2、MMP-9和TIMP-2mRNA的表達均顯著增加，MMP-9和TIMP-2總蛋白的表達顯著增加，MMP-2在癌旁組織和腫瘤組織中蛋白的表達無明顯差異。結果提示有神經周浸潤的胰腺癌組織中基質金屬蛋白酶MMP2/MMP9和組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2表達明顯增加，可能與胰腺癌早期易侵襲和轉移的特性相關，而MMP-2在癌旁組織和腫瘤組織中蛋白表達增加不明顯，推測是腫瘤組織中TIMP-2是MMP-2的特異抑制劑，其高表達在一定程度上抑制了MMP-2的表達，對MMP-9則無抑制作用，MMP-9高表達可增加腫瘤細胞的黏附能力，降解血管基底膜，促進腫瘤細胞向神經組織的轉移［11］。

綜上所述，MMP9和TIMP-2在有神經周浸潤的胰腺癌組織中mRNA和蛋白的表達均的表達顯著增加，其特異的高表達可為胰腺癌的診斷、治療及預后判斷提供重要參考依據，具體的分子機制還有待進一步研究。