AP2/ERF轉錄因子調控果實品質研究進展

宋康華 黎宇婷 張魯斌

摘? 要? 乙烯是影響果實品質形成的重要植物激素，乙烯信號轉導途徑研究已經在不同果實中廣泛開展，但其轉錄調控機制研究基本處于起步階段。本文重點綜述了AP2/ERF的果實品質轉錄調控研究進展，討論了果實品質轉錄調控存在問題和研究趨勢。

關鍵詞? 乙烯;AP2/ERF;轉錄調控;果實品質

中圖分類號? S31? ? ? 文獻標識碼? A

Abstract? Ethylene is an important plant hormone that affects the quality of fruit. Studies of ethylene signal transduction pathway have been widely carried out in different kinds of fruits， but its transcriptional regulation mechanism is still at the beginning stage. This paper summarized the progresses in the transcriptional regulation of fruit quality based on the AP2/ERF results. Perspective and problems for further exploration of AP2/ERF on the fruit quality improvement were also discussed.

Keywords? etheylene; AP2/ERF; transcriptional regulation; fruit quality

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.028

乙烯作為氣態的植物激素調控著植物的整個生長發育過程，如種子萌發、細胞伸長、果實成熟、器官的衰老與脫落、細胞程序死亡、激素調節以及對各種脅迫與病原體的響應[1]。近年來越來越多結果表明乙烯不僅影響躍變型果實和非躍變型果實的采后衰老，也參與調控果實品質相關基因的表達，影響了果實顏色、風味、質地等品質的形成與轉變。隨著模式植物（如擬南芥和水稻等）轉錄因子研究的重要突破，果實成熟和衰老過程中的轉錄調控機制已成為采后生物學研究的新熱點與重點之一，近年來，隨著基因組學、蛋白組學、轉錄組學及代謝組學，以及DNA-蛋白質和蛋白質-蛋白質互作等技術的發展，已相繼從各種果實中分離和鑒定出多種與成熟和衰老相關的轉錄因子，如EIN3/EIL、AP2/ERF、MADS-box、NAC 和SBP/SPL等[2]，EIN3/EILs和AP2/ERF是兩類植物特異的轉錄因子，乙烯反應是由涉及EIN3/EILs和ERF的轉錄因子家族的轉錄級聯反應介導的[3]，AP2/ERF家族轉錄因子作為乙烯信號通路中的最終目的基因，可通過調控各種下游靶基因的表達來參與植物整個生命周期的生長發育和各種逆境脅迫，可以調節植物激素的生物合成，包括乙烯、細胞分裂素、赤霉素和脫落酸，此外，AP2/ERF也參與了生長素、細胞分裂素、脫落酸和茉莉酸信號的響應，是連接植物激素信號的關鍵調節器。AP2/ERF的這種多重調節作用逐步被挖掘，既有有利的一面也有不利的一面，比如引起衰老、阻礙生長等，只有深入的探索和研究AP2/ERFs才能趨利避害，為果實品質生物學理論提供支撐。

本文著眼于乙烯信號轉導途徑AP2/ERF類轉錄因子，介紹乙烯調控果實產品品質的轉錄機制研究進展，明確基于AP2/ERF的果實品質轉錄調控研究重點與方向。

1? AP2/ERF轉錄因子簡介

AP2/ERF是一個龐大的基因家族， 根據AP2結構域的數目和結構特點，AP2/ERF可以分為4個亞族ERF、DREB、AP2、RAV和單獨成員soloist[4-5]，AP2亞類的成員含兩個相似度很高并且串聯重復出現的AP2/ERF結構域，少數成員包含1個AP2結構域，在調節植物生長發育過程中起著非常重要的作用;RAV蛋白家族含有1個AP2/ERF和1個B3結構域，在乙烯響應、油菜素內酯響應、生物和非生物脅迫響應過程中發揮重要的作用;CBF/DREB家族和ERF家族只含有1個AP2/ERF結構域，CBF/DREB家族成員可以識別干旱和冷誘導響應元件（DRE/CRT， A/ GCCGAC），在植物抵抗非生物脅迫過程中起著非常重要的作用;ERF 家族成員可以識別GCC盒（AGCCGCC），在植物抵抗生物脅迫過程中發揮重要的作用;Soloist類的AP2/ERF轉錄因子與其他成員間的進化關系最遠，成員數較少，如擬南芥中只報道1個成員[6]。目前主要報道了AP2和ERF兩類亞家族與果實成熟和衰老有關。AP2/ERF成員在不同果實中已被廣泛分離，且多個物種涉及基因組水平，在番茄[7]中分離得到112個ERFs、黃瓜[8]中分離得到131個ERFs、蘋果[9]中分離得到259個ERFs、桃[10]中分離得到131個ERFs、柑橘[11]中分離得到126個ERFs、白梨（碭山酥梨）[12]分離得到155個ERFs，獼猴桃[18]中分離得到105個ERFs，大棗中分離得到119個ERFs[13]、辣椒中分離得到141個ERFs[14]。

AP2/ERF蛋白是植物體內特有的也是植物中最大的轉錄因子家族之一，AP2/ERF在乙烯信號轉導下游發揮作用且高度保守，該族成員在植物生長發育、衰老過程中發揮重要作用，且涉及各種對周圍環境的生物脅迫及非生物脅迫[15]。Mishra[16]近年來研究發現罌粟中PsAP2在煙草中可以結合DRE和GCC順式作用元件進而響應各種生物脅迫和非生物脅迫，另外AP2/ERF還可以與其它植物激素代謝與互作，近年來研究表明AP2/ERF在果實成熟品質方面具有重要的調節作用，如顏色，質地，風味、芳香、抗逆性等，但是由于大部分模式植物不具有品質優良的肉質果實以及多年生果樹的遺傳轉化周期漫長等困難，因此AP2/ERF在果實品質性狀的轉錄調控研究方面鮮見報道。

2? AP2/ERF轉錄因子參與調控果實品質概述

2.1? 果實成熟軟化

乙烯在控制果實成熟（包括呼吸躍變型和非呼吸躍變型）發揮著重要的作用，調節果實中不同的成熟響應的乙烯信號通路下游ERF轉錄因子主要為ERF亞類和AP2亞類。AP2/ERF轉錄因子可以與乙烯合成相關基因相互作用來調節乙烯合成或者與單獨或與其他轉錄因子結合后作用在與成熟軟化相關的靶基因上來調控果實的成熟軟化，在果實成熟軟化方面的研究主要集中在呼吸躍變型果實中，最先在番茄中進行研究，后在香蕉、蘋果、獼猴桃等中相繼展開研究。比如在番茄中鑒定的AP2a，可以作用在RIN、NOR、CNR的下游，負調控果實的成熟[18]。Liu等[17]發現番茄基因組中有77個ERF轉錄因子，其中27個在果實成熟中上調表達，28個呈現負表達，這表明不同的ERF在果實發育成熟過程中扮演不同的角色。通過檢測番茄成熟突變體RIN、Nor、Nr中ERF的表達情況，發現11個ERF在突變體中低度表達，3個ERF出現積累，3個副族E成員ERF則在突變體中出現劇烈下調，預示它們在果實成熟中發揮著重要作用。Feng等[19]從香蕉果實中通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補分析表明MaDof23和MaERF9之間存在物理相互作用，前期研究表明MaDof23參與香蕉成熟調控，為轉錄抑制子，而MaERF9是轉錄激活子，二者相互拮抗共同調控10余個包括MaEXP1、MaEXP2、MaEXP3、MaEXP5、MaXET7、MaPG1、MaPME3、MaPL2、MaCAT、MaPDC在內的與香蕉成熟相關的基因。Fan等[20]從香蕉果實中鑒定了一個ERF亞家族的轉錄因子MaDEAR1，發現其表達和啟動子活性可以受到乙烯和成熟的抑制，推測其表達可能部分受到組蛋白修飾調節，MaDEAR1可以直接結合到與果實軟化相關的細胞壁修飾基因包括MaEXP1、MaEXP3、MaPG1、MaXTH10、MaPL3和MaPME3的啟動子來抑制其活性，進而調控果實的成熟。目前從獼猴桃數據庫中分離得到119個AcERF基因，其中8個ERF被確定參與果實的成熟軟化，AdERF10、AdERF14、AdERF15和AdERF75為正調控因子而AdERF7、AdERF8、AdERF19、AdERF21為負調控因子[21]。Xiao等[22]在香蕉中發現MaERF9可與乙烯合成途徑中的MaACS1、MaACO1的啟動子結合來正向調控其活性，進而參與香蕉果實成熟的調控。在蘋果中MdERF2可以結合到MdACS1 的啟動子上抑制其表達進而負調控乙烯合成，MdERF2也可與MdERF3的啟動子結合或者直接與MdERF3互作從而負調控乙烯合成[23]，茉莉酸通過調節MdMYC2與MdERF3啟動子結合來激活MdACS1的轉錄活性或者通過與MdERF2互作來增強MdACS1轉錄活性進而促進乙烯的合成[24]。類似結果也在白梨品種鴨梨中有所報道，鴨梨中ERF24可直接結合在ACO54的啟動子上進而啟動成熟相關基因的表達[25]。Leida等[26]在葡萄中鑒定一個漿果中特異表達的VviERF045，進一步分析表明該基因可調節蠟的生物合成和角質層的形態，并與另外6個VviERF相互協作共同調控果實的成熟。Palumbo等[27]也報道VviERF045在漿果成熟過程中起著總開關的作用。

果實質地包括果實的軟化和果實木質化，在果實成熟過程中合成的一系列細胞壁降解酶可以引起細胞壁結構和成分的改變從而導致果實軟化，推遲果實后熟過程中采取的延緩果實軟化腐爛的措施（比如低溫）往往會影響果實的其他方面的品質[28]，韓延超等[29]研究發現MaERF11作為轉錄抑制子，可以通過對乙烯合成基因MaACO1和果實軟化相關基因MaEXP2、MaEXP7、MaEXP8的抑制作用來調控乙烯的合成和果實的軟化。軟化是決定芒果果實貨架期的重要因素之一，Chidley等[30]發現乙烯處理明顯提高了阿方索芒果中β-D-半乳糖苷酶的轉錄活性，表明乙烯通過調控β-D-半乳糖苷酶和α-D-甘露糖苷酶在芒果軟化中發揮著極為重要的作用。與果實軟化相比，ERF參與果實木質化的研究嚴重滯后。有證據表明，APETALA2/ethylene response factor（AP2/ERF）乙烯響應因子可能與板藍根中木脂素的生物合成密切相關，即通過調節木質素類化合物合成過程中的相關基因和調節SA合成兩條途徑來控制木質素類化合物的合成[31]。Zeng等[32]從低溫貯藏過的枇杷果實采后木質化過程中分離出18個AP2/ERF基因，其中，EjAP2-1作為轉錄抑制子，其表達與木質化呈負相關，進一步研究表明EjAP2-1與木質素合成相關的EjMYB1 和 EjMYB2存在蛋白質-蛋白質間的互作，EjAP2-1與EjMYB1 或 EjMYB2的結合抑制Ej4CL1啟動子的活性。Li等[33]發現1-MCP能夠加劇獼猴桃在低溫下出現冷害木質化的現象，而POD基因可能在獼猴桃果實冷害木質化過程中扮演了重要角色，張魯斌等則發現ERF可能通過調控POD基因進而調控菜心低溫冷藏過程中乙烯誘導的木質化（待發表）。Wang[34]研究發現桃果實低溫馴化可通過一系列差異表達的ERFs來促進軟化和脂質成分的變化進而保持細胞膜的穩定性，達到減輕褐變和冷害的目的。

2.2? 果實色澤

色澤是果實重要的外觀品質，有呈綠色的葉綠素、呈紫色的花色苷、呈橙色的類胡蘿卜素、呈紅色的番茄素等。茉莉酸在許多物種中可以促進葉片衰老[35]，Tan等[36]在菜心中鑒定了一個可響應茉莉酸加速葉片衰老的BrERF72基因，進一步試驗表明BrERF72可直接結合在BrLOX4， BrAOC3，和BrOPR3的GCC-box及DRE/CRT順式元件上進而激活該基因的表達。 在水果諸如柑橘中，褪綠是促進果實品質形成重要的發展階段，果實色澤的轉錄調控研究主要為基于MYB的花青苷代謝研究和基于AP2/ERF的類胡蘿卜素代謝研究。Yin等[37]從甜橙變種—紐荷爾果果皮褪綠過程中分離了一個響應乙烯的乙烯響應因子CitERF13，CitERF13的功能在擬南芥和番茄中保守，與AtERF17、SlERF16同源作為PPH基因的激活子和葉綠素降解的促進劑。在蘋果中已發現AP2/ERF類轉錄因子可調控類胡蘿卜素生物合成途徑中關鍵酶的表達，Han等[38]在史密斯青蘋果果皮中未檢測到ERF17的表達，而補充 MaERF17促進了青蘋果果皮中葉綠素的降解及果皮的紅色著色，說明可能存在ERF17調控蘋果果皮脫綠的信號網絡。Zhang等[39]在番茄果實成熟過程鑒定了一個能夠抑制乙烯合成和類胡蘿卜素積累的MADS-box基因SlCMB1，進一步研究發現它和SlAP2a存在互作關系。Yao等[40]發現梨果實中PyERF3通過與PyMYB114以及PybHLH3互作來共同調控花青素的合成。巴良杰等[41]在紅肉火龍果果肉中得到HpERF1、HpERF2和HpERF3， 雙熒光素酶瞬時表達分析顯示，HpERFs可以激活紅肉火龍果甜菜紅素合成途徑上關鍵基因HpCyt P450-like1的啟動子活性，推測HpERFs可能通過調控甜菜紅素合成相關基因表達來參與紅肉火龍果果實品質形成過程。Wang等[42]研究認為ABA在花青素合成中起著更為重要的作用而乙烯則在葉綠素降解過程中起著更為重要的作用。在荔枝中ABA含量和乙烯釋放量隨著葉綠素的降解和花色素苷的合成而升高，而外施乙烯可顯著促進葉綠素的降解，在荔枝果皮成熟轉錄本中鑒定了3個ERFs，表明其參與了荔枝果皮成熟過程[43]。

2.3? 果實風味

果實風味是決定果實品質的重要因素，主要包括涉及糖酸代謝的糖酸比、澀味等，研究更多圍繞生理生化水平和代謝途徑展開，較少見轉錄調控相關研究。激素乙烯調節果實糖代謝的研究報道比較少見，前人報道抑制乙烯生物合成和乙烯作用對果實可溶性固形物含量沒有影響[44]，然而一些報道認為乙烯與糖代謝之間相互作用可能與糖的類型有關[45]。Macarena等[46]研究了乙烯對兩種成熟類型呼吸躍變型日本李及其芽變品種非呼吸躍變型日本李果實糖代謝的影響，發現乙烯可以降低蔗糖的分解代謝，誘導蔗糖生物合成，同時可刺激山梨醇分解降低山梨醇生物合成。此外，乙烯可正調控半乳糖代謝，與在非躍變型日本李中含量較高的半乳糖醇、棉子糖、肌醇和海藻糖含量成負相關，進而調控果實耐貯藏能力。

Chidley等[47]研究發現乙烯處理成熟及未成熟芒果均提高β-D-半乳糖苷酶和α-D-甘露糖苷酶的轉錄活性及還原性糖和非還原糖的積累。有機酸對果實風味至關重要，液泡氫離子轉運腺苷三磷酸酶（V-ATPase）在有機酸轉運和積累中起著重要作用，有研究報道[48]在柑橘中，CitVHA-c4與CitERF13基因在蛋白水平上相互作用協同調控檸檬酸水平，在擬南芥中，過表達CitERF13或AtERF17導致檸檬酸顯著積累。呂靜祎等[49]用乙烯處理蘋果發現常溫貯藏早期乙烯可促進TA下降，但對TSS沒有影響。袁莎等[50]在20 ℃用不同添加量的乙烯催熟（20 ℃）“紅陽”獼猴桃3～5 d，發現其對獼猴桃TSS和TA影響不顯著。

果實澀味主要由可溶性單寧引起，主要是柿（最顯著）、葡萄等少數果實。成熟的澀柿果實需進行采后脫澀方可食用，常用的處理為CO2、乙烯、高溫等[51]。研究發現AP2/ERF基因參與了柿果實澀味脫除的轉錄調控。Park等[52]發現DKEIL、DKERF2、DKERF5 和DKERF8可以響應柿果實（25 ℃）乙烯處理進而促使柿果實較15 ℃更快脫澀軟化。Wang等[53]發現了柿果實脫澀過程中響應缺氧的3個ERF轉錄因子（DkERF8、DkERF16、DkERF19），雙熒光素酶實驗證實DkERFs能夠激活DkXTH9啟動子進而參與細胞壁代謝。張慧敏等[54]研究發現黃瓜中CsERF在酵母和煙草體內均能夠激活Bi基因啟動子，說明CsERF能夠特異結合Bi基因啟動子的順式作用元件，正調控Bi基因的表達，導致黃瓜中葫蘆素C積累形成苦味。

2.4? 果實芳香

貯藏溫度和乙烯是影響果實采后貯藏果實香氣的兩個重要因素。在番茄果實中香氣物質合成的LOX途徑是依賴乙烯的過程[55]，HJD等[56]發現施用外源乙烯利可顯著提高芒果的呼吸速率，內源乙烯生產量和果實成熟過程中的脂肪酸含量，外源乙烯利的使用增加了總芳香揮發物、單萜、倍半萜、醛類、總酯、醇類和十四烷的產生。Jin等[57]在蘋果中研究發現1-MCP處理可顯著降低粉紅女士酯類、醇類和烷類香氣的種類和相對含量，在冷藏條件下1-MCP處理可以保持果實品質，但抑制了香氣的產生。類似的結果在花牛蘋果中也有報道，吳小華等[58]發現1-MCP可顯著降低呼吸和乙烯產生，延緩呼吸高峰和乙烯釋放高峰出現時間，但同時也抑制了與花牛蘋果香氣合成相關酶的活性。王貴章[59]發現乙烯通過ERF基因調控LOX、ALDH等家族基因的轉錄，進而影響己醛、苯甲醛、反-2-已烯醛、反-2-己烯醇等青草型香氣物質的合成;同時調控TPS14和MCS基因的表達和芳樟醇的合成。前人研究表明MaDREB2與香蕉果實成熟關系密切，并且可結合并激活香氣合成基因MaADH1和MaPDC的啟動子[60]。

2.5? 果實營養

果實的營養價值與果實中的抗氧化活性物質密切相關，這些物質包含酚類物質、萜類物質、維生素等，此前已有AP2/ERF調控藥用植物及其他作物代謝產物生物合成方面的研究[61]，如AP2/ERF轉錄因子TAR1正調控青蒿素合成;東北紅豆杉中AP2類轉錄因子TcDREB可能參與異戊二烯代謝途徑產物紫杉醇的合成;長春花中AP2/ERF類轉錄因子ORC1正調控幾個編碼參與煙堿生物合成的結構基因的酶;紫草中 LeERF-1可能對紫草素的生物合成起正向調節作用，Li等[62]已鑒定EREB58調控玉米倍半萜烯合成，AP2/ERF轉錄因子在采后貯藏過程中對果實營養物質影響的研究較少，目前在蘋果中報道AP2/ERF類轉錄因子可調控類胡蘿卜素生物合成途徑中關鍵酶的表達[63]，葡萄中也發現AP2/ERF類轉錄因子參與果實成熟過程ACC氧化酶、萜類合酶和脂氧合酶的基因表達調控[64]，Costa等[65]對不同品種藍莓進行乙烯處理發現乙烯對花青素組分的影響取決于品種，乙烯可促進部分品種花色苷總量的增加，提高藍莓采后果實的抗氧化能力，在蘋果愈傷組織中過表達MdERF1B可顯著增加膳食花青素和原花青素的積累[66]。

2.6? 果實抗逆性

采后貯藏過程中果實面臨各種生物脅迫及非生物脅迫，AP2/ERF轉錄因子家族中包含有DRE結合蛋白（DREBs），通過與DRE/CRT順式作用元件的特異性結合來激活非生物脅迫相關基因的表達[67]。冷害是果實采后低溫貯運的主要脅迫，在番茄中研究表明ERFs可以在低溫下被誘導表達，最近研究表明番木瓜中ERF1可以與多個順式作用元件結合并激活逆境脅迫相關基因和ABA合成相關基因，從而引起ABA含量升高進而提高耐鹽性和耐低溫性[68]，在黃瓜中也有ERFs參與冷鍛煉調控冷害發生的報道[69]。西葫蘆果實容易發生冷害，但對低溫貯藏的反應與品種有關，目前已篩選出包含AP2/ERF在內的一系列轉錄因子均參與了西葫蘆耐冷性的調節[70]。Qi等[71]研究表明香蕉果實中存在的轉錄抑制子MaERF10可招募MaJAZ3來抑制茉莉酸合成相關基因表達進而調控香蕉果實的耐冷性。低溫脅迫還會促使石榴果實PgERF1和PgERF2基因表達來誘導乙烯合成，進而增強低溫抗性[72]。Irene等[73]從高CO2濃度處理葡萄果實中鑒定一個VviERF2-c，發現其可與PR病程相關基因的順式作用元件GCC-box結合從而更好保持低溫下的果實品質。PHBs一直被認為是細胞周期負調控因子，Kong等[74]在擬南芥根發育中發現PHB3可通過限制響應活性氧的轉錄因子ERF115、ERF114和ERF109部分表達來維持QC和DSC并控制根分裂活性。Wang等[75]發現LTC （0 ℃貯藏之前8 ℃預貯5天）可以提高乙烯生成量，通過ERFs維持膜結構穩定降低褐變并減輕梨果實的冷害。糖苷生物堿是植物本身固有的抗菌物質，且具有廣泛的藥理活性[76]，Thagun等[77]在番茄果實發現了一組響應茉莉酸的ERF轉錄因子，在轉基因番茄中過表達和反義表達該基因均引起了甾體糖生物堿的劇烈變化，JRE4可激活甾體糖生物堿合成基因啟動子中的GCC-box從而調控該結構基因的表達。在果實衰老方面，Kuang等[78]用一氧化氮（NO）處理可以延緩龍眼果實的衰老，發現組蛋白去乙?；富駾lHD2可以與DlERF1互作共同調控龍眼果實的衰老。

3? 問題與展望

乙烯在果實的生長發育、成熟衰老及采收、貯藏到銷售等各階段都發揮著重要作用，是影響果實采后品質及貯藏期最重要的因素之一，在采后保鮮中抑制乙烯的作用可以延緩果實的成熟衰老，但同時也影響了果實品質，如何在采后保鮮過程中合理控制和使用乙烯是果實采后品質研究的重要方面。通過對AP2/ERF調控果實品質的研究，對提高果實采后貨架期品質具有深刻的指導意義，然而由于AP2/ERF轉錄因子家族成員眾多且成員之間存在功能交織和功能冗余的問題，給AP2/ERF功能的進一步研究帶來諸多挑戰[79]。目前對AP2/ERF轉錄調控機制和功能解析主要集中在模式果實番茄中，而多年生果樹中主要開展相關基因分離和轉錄分析研究，較為深入的轉錄調控機制研究僅在蘋果、獼猴桃、香蕉等少數果實中報道，且相關成員的功能驗證鮮見報道。

順境出產量，逆境出品質，AP2/ERF轉錄因子做為控制潛在的抗性相關基因表達的開關之一[80]，其深入研究對于提高果實品質及抗逆性等具有重要的理論指導意義，比如通過對耐貯存，營養品質高的優良果實品種ERFs轉錄因子的挖掘，可對分子育種提供參考;再比如施用低濃度的乙烯是否可增強果實品質（特別是在非躍變呼吸型果實中）而又不引起果實的成熟衰老？乙烯催熟到底對果品品質有沒有影響等。目前雖然國內外對AP2/ERF轉錄因子已經有較多報道，但對于果實特異的品質性狀轉錄調控機制研究及功能解析還不夠深入和準確，AP2/ERF對果蔬品質影響的共同規律有待于繼續探討，離實際生產應用更是相隔甚遠，篩選到符合實際需求的ERFs，對產前提高果實商品品質（色澤、風味、芳香、營養），產后降低冷害發生等具有實際意義，對進一步應用基因編輯技術對品種進行改良具有重要價值。

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