橡膠樹炭疽菌CsHog1基因的克隆和原核表達分析

廖小淼 何其光 劉耀 徐良向 周曉韻 劉文波 張宇 林春花 繆衛國

摘? 要? HOG MAPK途徑在植物病原真菌生長發育、致病過程和對殺菌劑敏感性等方面發揮重要功能，但在不同的病原真菌中具有一定差異。為研究Hog1蛋白在橡膠樹炭疽菌（Colletotrichum siamense）中的功能和調控機制，本研究利用同源克隆法克隆獲得橡膠樹炭疽菌（C. siamense）的CsHog1基因，構建GST-CsHog1融合表達載體，利用SDS-PAGE和Western Blot檢測蛋白表達情況。結果表明：橡膠樹炭疽菌（C. siamense）的CsHog1基因大小1383 nt，編碼459個氨基酸，包含5個內含子，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域;聚類分析顯示橡膠樹炭疽菌的CsHog1基因編碼的氨基酸序列與黃瓜炭疽菌的ClOsc1（Hog1同源基因）同源性最高。所構建的蛋白融合表達載體在供試條件下（IPTG 0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L;溫度16、25、28 ℃）均可較好誘導表達，GST-CsHog1融合蛋白大小約為70 ku。用GST親和層析柱純化獲得蛋白，經Western Blot檢測顯示該蛋白可與GST單克隆抗體特異性結合。

關鍵詞? 橡膠樹;橡膠樹炭疽菌;Hog1基因;蛋白純化;原核表達

中圖分類號? S794.1? ? ? 文獻標識碼? A

Abstract? The high osmolarity glycerol （HOG） response pathway plays important roles in growth and development， pathogenesis， fungicide sensitivity etc. in phytopathogenic fungi， but its function may vary in different pathogenic fungi. In this study， sHog1 was cloned by homologous cloning from Colletotrichum siamense isolated from rubber trees in order to understand the role and regulatory mechanisms of Hog1 protein. GST-Hog1 fusion protein expression vectors were also constructed and expressed in Escherichia coli BL21 （DE3）. The expressed fusion proteins were analyzed on SDS-PAGE and Western Blotting. The results showed that CsHog1 contained 5 introns and encoded 459 amino acids and had the Serine / Threonine protein kinases catalytic domain S_TKc. Phylogenetic clustering showed that CsHog1 shared the highest similarity to ClOsc1 （Hog1 homologue） of C. lagenarium. SDS-PAGE analysis showed that GST-Hog1 protein was successfully expressed in E. coli under the induction of IPTG at 0.3， 0.5， 0.8 and 1.0 mmol/L and at incubation temperature of 16， 25 or 28 ℃. The size of the fusion proteins was 70 ku which was identical to the expected molecular weight. Western Blotting showed that the purified fusion protein could be recognized by GST antibodies.

Keywords? rubber tree; Colletotrichum siamense; Hog1 gene; protein purification; prokaryotic expression

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.014

HOG MAPK途徑（High Osmohrity Glycerol Mitogen-activated Protein Kinase Signaling Transduction Pathway）是生物體MAPK途徑中參與滲透壓響應的重要通路，在植物病原真菌中還可能參與病菌致病過程、營養生長、殺菌劑敏感性、有性和無性生殖以及氧化、細胞壁修飾和其他應激反應等。現有研究表明，除了參與滲透調節功能外，HOG MAPK途徑在不同植物病原真菌中的功能具有物種特異性，在西瓜炭疽菌（Colletotrichum orbiculare）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、稻胡麻斑病菌（Bipolaris oryzae）中與病原菌致病能力無明顯相關性，而在禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、旋孢腔菌（Cochliobolus sativus）等病原真菌中則參與致病;在大麗輪枝菌（Verticillium dabliae）、灰葡萄孢菌（B. cinerea）、西瓜炭疽菌（C. orbiculare）、黃瓜炭疽菌（C. lagenarium）、異旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）中參與調控病原菌對咯菌腈等吡咯類殺菌劑的敏感性;在禾谷鐮孢菌（F. graminearum）、稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）、旋孢腔菌（C. sativus）中參與菌絲生長，而在西瓜炭疽菌（C. orbiculare）、稻瘟病菌（M. oryzae）、灰葡萄孢菌（B. cinerea）等真菌中則不參與[1-8]。

橡膠是我國四大戰略物資之一，對我國的經濟及國防建設具有重大意義。橡膠樹炭疽病是橡膠樹的一種重要葉部病害[9]。其病原菌主要有膠孢炭疽菌復合群（C. gloeosporioides species complex）和尖孢炭疽菌復合群（C. acutatun species complex），其中C. siamense膠孢炭疽菌復合群為主要類群[10-11]。實驗室前期研究顯示橡膠樹炭疽菌HOG MAPK途徑與病原菌對殺菌劑咯菌腈（fludioxioil）的抗性相關[12]。但炭疽菌是如何通過HOG1 MAPK信號途徑調控對咯菌腈的抗性，其上下游調控基因及作用機制等仍是未知的。本研究采用同源法克隆獲得我國海南橡膠樹炭疽菌優勢種群C. siamense Hog1同源基因，并構建了該基因的原核表達載體，在大腸桿菌中成功表達獲得GST-CsHog1融合蛋白及其純化蛋白，為進一步以Hog1蛋白為誘餌釣取其互作蛋白，深入研究HOG1 MAPK信號途徑在炭疽菌對咯菌腈抗性調控機理的研究奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株及質粒? 橡膠樹炭疽菌C. siamense HN08分離自海南瓊中新進農場橡膠樹病葉，由本實驗室分離鑒定保存[10];大腸桿菌Escherichia coli DH5a和載體PMD-18T購自大連TaKaRa公司;工程菌BL21（DE3）和表達載體pGST由海南大學陶均老師惠贈。

1.1.2? 試劑? 高保真DNA聚合酶、蛋白質Marker、DNA Marker、RNA反轉錄試劑盒One-step gDNA Removal和cDNA Synthesis SuperMix均購自北京全式金生物技術有限公司;限制性內切酶（BamHⅠ和HindⅢ）購自寶生物工程（大連）有限公司;凝膠DNA小量回收試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司;質粒提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司;GST標簽蛋白純化試劑盒、PMSF（苯甲基磺酰氟）購自上海碧云天生物技術有限公司;GST單克隆抗體購自proteintech公司;熒光二抗購自Abcam公司;T4 DNA連接酶，IPTG購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒，Tween-20購自北京索萊寶科技有限公司;考馬斯亮藍染色液和脫色液購自廣州賽國生物科技有限公司;RNA prep Pure試劑盒與2×Taq PCR Master mix購自TIANGEN公司;10×PBS、4×蛋白質上樣緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司;10×RealBlot快速轉膜液購自廣州賽國生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.1.3? 培養基? LB培養基配方及制備方法參照王茜[13]的方法進行。

1.2? 方法

1.2.1? 橡膠樹炭疽菌C. siamense CsHog1基因的克隆和分析? 參照RNAprep Pure試劑盒說明書操作步驟提取總RNA，按照反轉錄試劑盒步驟反轉錄合成cDNA。在NCBI數據庫搜索獲得炭疽菌Hog1基因序列（BAD11137.1），利用本地BLAST法在橡膠樹炭疽菌（C. siamense）HN08轉錄組序列數據庫（本實驗室保存）中比對獲得同源序列，設計引物對CS-HOG1-OF（5′-CGCGG ATCCGCGGAATTCATCAGAGCACA-3′）和CS- HOG1-OR（5′-CCCAAGCTTCTATTGCCCGTTGAATTGCTGCTCC-3′），分別以橡膠樹炭疽菌C. siamense HN08的DNA和cDNA為模板進行擴增，反應體系為：DNA/cDNA模板1 μL，上下游引物1 μL，2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總反應體積25 μL。反應條件為：95 ℃，5 min;95 ℃，30 s;58 ℃，30 s;72 ℃，60 s;35個循環后，72 ℃，10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。并將PCR產物回收連接載體PMD-18T獲得重組質粒，連接產物轉化感受態細胞DH5a，經過PCR驗證正確，取陽性轉化子，送往深圳華大基因研究院測序。重復3次。

比較分析DNA和cDNA序列，了解外顯子和內含子，并與GenBank中同源序列進行分析，參考基因序列信息見表1，利用NCBI網站上的BLASTx軟件完成。cDNA序列翻譯成氨基酸序列，利用在線的簡單模塊構架搜索工具（Simple modular architecture research tool， SMART; http：//smart.embl-heidelberg. de/smart/set_mode.cgi）對氨基酸序列進行結構功能域分析;用網站（http：//web.expasy. org/protparam/）預測融合蛋白分子量。

1.2.2? 橡膠樹炭疽菌C. siamense CsHog1基因表達載體的構建? 以cDNA為模板克隆獲得的質粒命名為pMD-CsHog1，用限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ酶切質粒pMD-CsHog1和原核表達載體pGST，利用T4 DNA連接酶將CsHog1片段連接到pGST表達載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞E. coli DH5a，涂布于含有50 ?g/L卡那霉素的LB平板，37 ℃培養過夜，挑取若干單克隆菌落菌液PCR驗證陽性克隆。測序正確后搖菌提質粒轉化大腸桿菌感受態細胞BL21（DE3），質粒命名為GST-CsHog1。

1.2.3? GST-CsHog1融合蛋白的誘導表達? 挑取GST-CsHog1單菌落和pGST單菌落（對照）接種于含50 ?g/L氨芐的5 mL LB培養基的試管中，在37 ℃搖菌培養過夜，吸取1 mL菌液轉移至含氨芐的100 mL LB培養基錐形瓶中，37 ℃搖菌培養至OD600值0.6～0.8，再向錐形瓶中加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，在28 ℃搖床誘導6 h試表達，以空載體為對照。收集菌體重懸于4 ℃預冷的PBS中，加入終濃度0.5 mmol/L蛋白酶抑制劑?使用超聲破碎儀破碎菌體至菌液澄清，將破碎澄清的菌體離心15 min后，分別取上清和沉淀各30 μL分別進行SDS-PAGE檢測。GST-CsHog1融合蛋白試表達后，對IPTG濃度誘導條件進行選擇，分別在菌液中加入終濃度為0、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG誘導劑，置于28 ℃，6 h培養，按上述方法進行SDS-PAGE檢測。對溫度誘導條件進行選擇，在菌液中加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導劑，分別置于16、25、28、37 ℃，培養6 h，按上述方法進行SDS-PAGE檢測。

1.2.4? 免疫印跡試驗Western blot? 制作濃度為12%的SDS-PAGE蛋白膠，操作過程中盡量避免氣泡的產生。將提取的蛋白上清上樣。跑SDS-PAGE蛋白膠，電泳恒壓80V。 在SDS-PAGE 進行電泳結束前十分鐘，將4張小濾紙與膜剪好，將4張小濾紙、海綿、夾子一起提前浸泡于裝有1×transter buffer 的鐵盤中待用。將膜侵泡在甲醛中15 s后將膜轉移到裝有轉膜緩沖液的鐵盤里，膜反復侵泡至膜上水不聚成滴。待SDS-PAGE蛋白膠跑好后，將膠取出并侵泡在預冷的裝有轉膜緩沖液的鐵盤中。將膜和膠放置好后，電壓120 V，電流300 mA，轉膜0.5 h。膜轉好后在4 ℃的條件下用含有5%脫脂奶粉的PBST封閉膜8～10 h。然后加入GST抗體，GST抗體和5%脫脂奶粉的PBST的比例為1∶5000，4 ℃孵育8～10 h。用PBST洗膜3次，每次15 min。 在含有5%脫脂奶粉的PBST中加入熒光二抗，熒光二抗和5%脫脂奶粉的PBST的比例為1∶5000，室溫孵育45 min。 用PBST洗膜3次，每次15 min。掃膜拍照。

1.2.5? 蛋白純化? 利用碧云天公司提供的GST標簽蛋白純化試劑盒進行純化。取1 mL混合均勻的BeyoGold GST-tag Purification Resin，4 ℃，1000 r/min離心30 s， 棄去儲存液，向凝膠中加入0.5 mL裂解緩沖液重懸并平衡凝膠，4 ℃，1000 r/min離心30 s，棄去液體重復平衡一次，將蛋白上清加入其中，4 ℃在水平搖床上緩慢搖動1 h，將上清和凝膠的混和物裝入親和層析柱管中，將純化柱底部蓋子打開，使柱中液體流出，收集30 ?L流出液作后續分析用，洗柱5次，每次加入0.5 mL裂解緩沖液，每次收集30 ?L洗滌液作后續分析用，加入0.5 mL洗脫緩沖液，重懸凝膠，流出洗脫液。重復5～6次。純化結果進行SDS-PAGE檢測。

2? 結果與分析

2.1? 橡膠樹炭疽菌C. siamense CsHog1基因的克隆和序列分析

橡膠樹炭疽菌C. siamense CsHog1基因的PCR擴增電泳結果。將擴增獲得序列進行測序分析，結果顯示，所得基因序列包含完整的開放閱讀框架數據，克隆獲得CsHog1基因的DNA序列大小為1383 nt（登錄號：MG88 7856），獲得cDNA序列大小為1080 nt（GenBank登錄號：MG887857），該基因含有5個內含子，編碼459個氨基酸。利用在線蛋白質結構域預測軟件分析，該蛋白含有S_TKc結構域，該結構域為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域。

將CsHog1氨基酸序列與GenBank中已有炭疽菌及其他真菌的同源蛋白進行序列比對，結果表明，橡膠樹炭疽菌（C. siamense）CsHog1與稻瘟病菌（M. oryzae）、層生鐮刀菌（F. proliferatum）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和黃瓜炭疽菌（C. lagenaria）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）的Hog1蛋白高度同源（95%以上），聚類分析顯示其與黃瓜炭疽菌的ClOsc1聚為一類。

2.2? GST-CsHog1融合蛋白表達載體的構建、表達和純化

分別挑取含融合表達質粒GST-CsHog1和對照質粒pGST的單菌落，按照上述方法誘導表達，提取粗蛋白進行SDS-PAGE檢測顯示，在70 ku左右處有一條明顯條帶，與預期蛋白大小相符，說明融合蛋白GST-CsHog1在大腸桿菌BL21中成功表達，融合蛋白在上清和包涵體中均有存在。不同IPTG濃度對GST-CsHog1融合蛋白表達的影響，在0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG濃度下，GST-CsHog1融合蛋白均可較好誘導表達，無顯著差異。不同溫度誘導GST-CsHog1融合蛋白表達的結果，結果顯示，在16、25、28 ℃誘導條件下融合蛋白表達量較好。

將表達的含CsHog1蛋白的上清液用GST親和層析柱純化。可獲得與融合蛋白分子量一致的目的條帶。GST蛋白的成功純化。

2.3? 融合蛋白GST-CsHog1的Western blot驗證

為了證實表達的蛋白是GST-CsHog1，使用GST單克隆抗體，熒光抗體進行Western blot，結果顯示融合蛋白GST-CsHog1可以和GST標簽單克隆抗體結合，得到的目的條帶的大小與融合蛋白GST-CsHog1分子量一致，該結果進一步說明GST-CsHog1融合蛋白在大腸桿菌BL21中成功表達。

3? 討論

本研究通過同源克隆法獲得橡膠樹炭疽菌C. siamense的CsHog1基因，該基因編碼的氨基酸序列與稻瘟病菌（M. oryzae）、層生鐮刀菌（F. proliferatum）、球孢白僵菌（B. bassiana）等真菌的Hog1蛋白一樣都含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域，且與它們同源性極高，其中與黃瓜炭疽菌（C. lagenaria）ClOsc1同源性最高，推測該蛋白與黃瓜炭疽菌ClOsc1功能相似。本研究構建了GST-CsHog1融合蛋白表達載體，并進行了原核表達。根據前人報道，誘導溫度和IPTG濃度可能影響菌體的生長和融合蛋白的表達。本研究設置了不同誘導溫度和不同IPTG濃度，結果顯示在供試條件中，上清液和包涵體中均存在GST-CsHog1融合蛋白，但16、25、28 ℃誘導條件下融合蛋白在上清中的表達量比37 ℃高，在0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG濃度下，GST- CsHog1融合蛋白的表達并沒有顯著差異。在本研究中，雖然包涵體中融合蛋白含量較多，但在上清中能清晰看到融合蛋白的條帶，并通過Western blot驗證確認該條帶為目的蛋白。為獲得較多的可溶性蛋白，本研究純化時加大了誘導菌體的量，用GST親和層析柱純化得到與融合蛋白GST-Hog1分子量一致的目的條帶。但得到的純化蛋白中有與GST大小一致的條帶，分析原因可能是純化過程中GST-Hog1融合蛋白斷裂導致，另外在融合蛋白GST-Hog1的下方也有一個條帶，分析原因可能是純化過程中GST-Hog1融合蛋白斷裂后的Hog1蛋白。GST-Hog1融合表達載體的成功構建及GST-Hog1融合蛋白的獲得，為后續釣取CsHog1蛋白互作蛋白，深入研究HOG1 MAPK在炭疽菌的功能奠定了基礎。

HOG MAPK途徑在生物體中與殺菌劑、鹽脅迫、生長等密切相關。Hog1作為該途徑的關鍵基因，其所編碼的蛋白與其他的蛋白互作共同發揮作用。例如：在芽殖酵母中Hog1p是第一個直接調節Aft1p的激酶，Hog1p-Aft1p相互作用若減少會導致Aft1p去磷酸化從而影響鐵的穩態[14]。在白色念珠菌中細胞壁糖苷酶DFG5和DCW1是Hog1磷酸化所必需的[15]。在球孢白僵菌中Bbakr1是Hog1 MAPK通路的下游靶基因，它編碼阿爾多酮還原酶，參與調控滲透和鹽脅迫，與Bbhog 1關系密切[16]。盡管在多種真菌中HOG MAPK途徑已經被較好的研究，但是該信號途徑上下游網絡并不十分清楚。炭疽菌HOG MAPK信號途經與咯菌腈等吡咯類殺菌劑及鹽脅迫等方面也密切相關[17]，但炭疽菌是如何通過HOG信號途徑調控對殺菌劑的抗性，其中有哪些關鍵調控基因，它們的作用機制如何仍是未知。本研究成功獲得HOG MAPK途徑重要成員CsHog1蛋白，為釣取與CsHog1蛋白互作的蛋白以及豐富HOG MAPK 信號網絡成員奠定基礎。

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