CLCA4基因在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達與其臨床意義

張永紅 劉雅麗

[摘要]目的 探討CLCA4基因在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達與其臨床意義。方法 利用癌癥和腫瘤基因圖譜（TCGA）數據庫，基于生物信息學檢測CLCA4在頭頸部鱗狀細胞癌中的表達情況，通過分析網站中TCGA數據庫的552例頭頸部鱗狀細胞癌患者（時間截止至2018年10月），繪制頭頸部鱗狀細胞癌中CLCA4在各種條件下的箱式圖。并通過生存曲線、蛋白-蛋白相互作用網絡（PPI）、基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析探討CLCA4基因差異表達在頭頸部鱗狀細胞癌對患者產生的影響與重要性和判定差異基因主要影響的生物學功能或者通路。結果 CLCA4在頭頸部鱗狀細胞癌中表達顯著下調（P<0.05），同時，CLCA4的低表達和較差的預后相關（P=0.01883）。PPI、GO和KEGG分析結果顯示，CLCA4除了參與離子通道與表皮發育等調控，還發現其與免疫、炎性反應相關。結論 CLCA4在頭頸部鱗狀細胞癌參與免疫調節作用，提示頭頸部鱗狀細胞癌的免疫異常可能是影響患者生存率的關鍵，同時為頭頸部鱗狀細胞癌提供了全新的研究方向與思路。

[關鍵詞]CLCA4；癌癥和腫瘤基因圖譜；頭頸部鱗狀細胞癌；免疫；炎性；大數據

[中圖分類號] R739.91 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（b）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of CLCA4 gene in head and neck squamous cell carcinoma. Methods The expression of CLCA4 in head and neck squamous cell carcinoma was detected by using TCGA database based on bioinformatics. A box diagram of CLCA4 in head and neck squamous cell carcinoma under various conditions was drawn by analyzing 552 head and neck squamous cell carcinoma patients （up to October 2018） in the cancer genome atlas （TCGA） database of website. The effects and importance of CLCA4 gene differential expression on patients with head and neck squamous cell carcinoma and the biological function or pathway of determining the main effects of different genes were discussed by survival curve， protein-protein interaction network （PPI）， gene ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome （KEGG）. Results The expression of CLCA4 was significantly down-regulated in head and neck squamous cell carcinomas， and the low expression of CLCA4 was associated with poor prognosis （P=0.01883）. The results of PPI， GO and KEGG analysis showed that CLCA4 was not only involved in the regulation of ion channels and epidermal development， but also related to immune and inflammatory responses. Conclusion CLCA4 participates in the immunoregulation in head and neck squamous cell carcinoma， suggesting that the immune abnormality of head and neck squamous cell carcinoma may be the key factor affecting the survival rate of patients， and provides a new research direction and ideas for head and neck squamous cell carcinoma.

[Key words] CLCA4； The cancer genome atlas； Head and neck squamous cell carcinoma； Immunity； Inflammation； Big data

頭頸部鱗狀細胞癌在全球范圍內常見惡性腫瘤類型中位居第六[1]，其誘發頭頸部鱗狀細胞癌的發生的危險因素很多，其中包括吸煙、飲酒和環境、飲食因素[2]。雖然醫療界一直有新的治療頭頸部鱗狀細胞癌的方法（如手術的改進），但是在過去30年內，頭頸部鱗癌患者的5年總生存率仍然很低，并無明顯改進[3]。有鑒及此，加深對頭頸部鱗狀細胞癌發病機制的了解是必須的而且很重要，故本研究選擇從分子水平研究頭頸部鱗狀細胞癌的發生、發展，這樣有利于發現新的分子靶點，并可以提供新的治療手段與新思路。

1材料與方法

1.1頭頸部鱗狀細胞癌組織中CLCA4的信息提取

552例頭頸部鱗狀細胞癌患者組織樣本來源于癌癥和腫瘤基因圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/），時間截止至2018年10月。下載并預處理頭頸部鱗狀細胞癌相關數據集的mRNA表達資料，在R語言安裝edgeR包的條件下，分析CLCA4的表達情況。通過LinkedOmics（http：//www.linkedomics.org/）對頭頸部鱗狀細胞癌分析CLCA4基因。

1.2頭頸部鱗狀細胞癌組織中與CLCA4相關性最高的100個基因的富集分析

頭頸部鱗狀細胞癌中CLCA4相關基因則通過Spearman Correlation test計算，并以熱圖與火山圖展示。利用在線網站Metascape（http：//metascape.org/）進行基因本體（GO）分析，京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。以判定預后基因主要影響的生物學功能或者通路。頭頸部鱗狀細胞癌中CLCA4的相關基因同樣以上述方法進行富集分析。

1.3目標基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡圖

利用在線網站Metascape（http：//metascape.org/）繪制與富集結果結合的PPI網絡圖，進一步查證富集與基因之間的關系。

1.4 頭頸部鱗狀細胞癌中CLCA4表達相關分析

利用LinkedOmics在線軟件（http：//linkedomics.org/）對頭頸部鱗狀細胞癌中的CLCA4進行計算與分析，通過分析網站中TCGA數據庫的552例頭頸部鱗狀細胞癌患者，繪制頭頸部鱗狀細胞癌中CLCA4在各種條件下的箱式圖。

1.5統計學方法

統計學結果由LinkedOmics在線軟件計算，變量之間的相關性采用Spearman相關性分析方法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 頭頸部鱗狀細胞癌中與CLCA4基因的相關性分析

通過TCGA分析，CLCA4在頭頸部鱗狀細胞癌中高度下調（P<0.05）。同時CLCA4的低表達和較差的預后相關（P=0.01883）（圖1）。由于CLCA4在癌癥中相關的報道不多，為了進一步獲得CLCA4的相關信息，通過TCGA查找頭頸部鱗狀細胞癌中與CLCA4相關的基因，并通過Spearman相關性分析，并進行數據可視化，繪制火山圖（圖2）展示CLCA4與其他基因的相關系數，基因相關性以0點為分界線按區域進行劃分，右區表示基因與CLCA4成正相關（P<0.05）（圖2），左區表示基因與CLCA4成負相關（P<0.05）（圖2），P值越小，表示該基因與CLCA4的相關性越高。

2.2 CLCA4在頭頸部鱗狀細胞癌可能參與的調控相關因素

為了研究CLCA4在頭頸部鱗狀細胞癌可能參與的主要調控，按P值取與CLCA4相關性最高的頭100個基因進行富集分析（圖3，表1）。并結合PPI網絡圖聯合分析（圖4，見封四）。通過分析結果可以看出CLCA4在頭頸部鱗狀細胞癌中除了可能參與離子通道、表皮發育與細胞分化方面的調節之外，還與免疫相關，并且互相影響。

3討論

腫瘤一直是人類未曾攻克的世界級難題，據大規模統計結果分析2014年全國范圍內人群的惡性腫瘤發病率達到了235.23/10萬（其中男性為268.65/10萬、女性為200.21/10萬），中標率達到184.58/10萬，其中城市中標發病率為187.53/10萬，農村地區中標發病率為181.10/10萬[4]。頭頸部鱗狀細胞癌是世界第六大常見惡性腫瘤，在頭頸部惡性腫瘤中，>90 %的病例均為鱗狀細胞癌。根據大規模數據統計，全球頭頸部鱗狀細胞癌發病率為（10～15）/10萬，占全身惡性腫瘤的16%～40%[5-6]，每年全球新增約500 000例頭頸部鱗狀細胞癌的患者[7]。我國 HNSCC 占全身惡性腫瘤的10%，2000 年我國每100 000人頭頸部鱗狀細胞癌的男、女年齡標準化發病率（age-standardized incidence rate per 100 000，ASR）分別為1.2%和0.7%，到2005年這個數字已上升為1.2%和0.8%[8]。

目前，通過計算機技術進行的生物信息學分析在腫瘤研究的各個方面有了廣泛應用[9]，其中包括芯片分析和RNA測序在內的高通量分析篩選。CLCA4基因在多種癌癥中都具有重要臨床意義，但是目前并沒有研究、討論CLCA4在頭頸部鱗狀細胞癌中的作用與機制。在這項研究中，通過大數據分析，發現與正常組織比較，CLCA4的表達在頭頸部鱗狀細胞癌中被高度下調，這與其他癌癥的文獻報道趨勢一致。此外通過此項分析還發現患者CLCA4低表達的預后較CLCA4高表達者差。

本研究通過挑選100個與CLCA4相關性最高的基因進行后續研究，進行富集與蛋白-蛋白相互作用網絡分析，發現CLCA4在頭頸部鱗狀細胞癌中很可能參與免疫與炎性反應的調控，而免疫與炎性反應在癌癥中具有重要意義[10-11]，與癌癥關系密切，免疫與炎性反應在癌癥中會極大地影響癌細胞的增殖、分化、存活、耐藥、轉移、侵襲力以及預后等相關問題，根據分析結果，可見CLCA4的下調與頭頸部鱗狀細胞癌中的免疫調節存在相關性。

目前對CLCA4在癌癥中的研究集中在離子通道與表皮發育兩方面[12-15]。有研究表明，CLCA4的過度表達極大地減弱了膀胱癌細胞的增殖、生長、遷移和侵襲能力，而CLCA4較低具有相反的作用[12-15]。此項數據分析除驗證了文獻中的結果外，還同時發現CLCA4可能參與調節自然殺傷細胞介導的免疫應答對抗原刺激的炎癥反應。同時還觀察到CLCA4可能參與外泌體的調節。癌細胞分泌的外泌體在癌癥的發生及惡化過程中起著重要作用[16]。外泌體可促進癌細胞的增殖、擴散及幫助癌細胞逃離來自體內自身或者體外的清除機制[17]。在臨床，癌細胞分泌的外泌體可以作為癌癥診斷的分子標志物[18]。所以CLCA4具有重要的臨床意義與價值。

綜上所述，本次分析結果提示CLCA4不止是新的研究方向與研究靶點，同時還是非常有潛力的頭頸部鱗狀細胞癌生物標志物。希望此項研究結果可以為頭頸部鱗狀細胞癌的基礎研究和臨床實踐提供進一步的理論指導，并希望可在日后繼續對頭頸部鱗狀細胞癌基因進行更深入地研究與分析。

[參考文獻]

[1]Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74-108.

[2]Haddad RI，Shin DM.Recent advances in head and neck cancer[J].N Engl J Med，2008，359（11）：1143-1154.

[3]Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2009，59（4）：225-249.

[4]Kouskoumvekaki I，Shublaq N，Brunak S.Facilitating the use of large-scale biological data and tools in the era of translational bioinformatics[J].Brief Bioinform，2014，15（6）：942-952.

[5]李洪娟.關于腫瘤病人臨終關懷護理影響因素的進展研究[J].保健文匯，2017，（5）：106.

[6]Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010[J].CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.

[7]Leemans CR，Braakhuis BJ，Brakenhoff RH.The molecular biology of head and neck cancer[J].Nat Rev Cancer，2011，11（1）：9-22.

[8]Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87.

[9]Yang L，Parkin M，Ferlay J，et al.Estimates of cancer incidence in china for 2000 and projections for 2005[J].Cancer Epidem Biomar，2005，14（1）： 243-251.

[10]Li T，Guo H，Zhao X，et al.Gastric cancer cell proliferation and survival is enabled by a cyclophilin B/STAT3/miR-520d-5p signaling feedback loop[J].Cancer Res，2017，77（5）：1227-1240.

[11]Fankhauser M，Broggi MAS，Potin L，et al.Tumor lymphangiogenesis promotes T cell infiltration and potentiates immunotherapy in melanoma[J].Sci Transl Med，2017，9（407）：pii：eaal4712.

[12]Yu Y，Walia V，Elble RC.Loss of CLCA4 promotes epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer cells[J].PLoS One，2013，8（12）：e83943.

[13]Hou T，Zhou L，Wang L，et al.CLCA4 inhibits bladder cancer cell proliferation，migration，and invasion by suppressing the PI3K/AKT pathway[J].Oncotarget，2017，8（54）：93 001-93 013.

[14]Bundela S，Sharma A，Bisen PS.Potential therapeutic targets for oral cancer：ADM，TP53，EGFR，LYN，CTLA4，SKIL，CTGF，CD70[J].PLoS One，2014，9（7）：e102610.

[15]Yang B，Cao L，Liu B，et al.The transition from proliferation to differentiation in colorectal cancer is regulated by the calcium activated chloride channel A1[J].PLoS One，2013，8（4）：e60861.

[16]Greening DW，Gopal SK，Xu R，et al.Exosomes and their roles in immune regulation and cancer[J].Semin Cell Dev Biol，2015，40：72-81.

[17]Paggetti J，Haderk F，Seiffert M，et al.Exosomes released by chronic lymphocytic leukemia cells induce the transition of stromal cells into cancer-associated fibroblasts[J].Blood，2015，126（9）：1106-1117.

[18]Lin J，Li J，Huang B，et al.Exosomes：novel biomarkers for clinical diagnosis[J].Sci World J，2015，2015：657 086.

（收稿日期：2018-11-22 本文編輯：許俊琴）