寶寶樂顆粒對幼鼠脾胃虛寒型非特異性功能性腹痛作用研究

石 菊，白 冰，許艷茹，倫宗慧，曲曉峰，邊 雨，鄭麗紅，徐 建*

功能性胃腸病（FGIDs）［1］，又稱腸腦互動異常，是一組因動力紊亂、內臟高敏感、黏膜免疫功能改變、腸道菌群改變、中樞神經系統處理功能異常［2］等因素引起的以腹痛、惡心嘔吐、腹瀉便秘、難以排出食物或糞便為特征的非器質性消化道紊亂性疾病.根據2016年發表兒童功能性胃腸病羅馬Ⅳ標準，FAP-NOS的患兒經常有非特異性的胃腸道外軀體癥狀，應特別關注的是自主神經癥狀.目前研究認為，FAP-NOS可能是一種中樞性疼痛，由于多種因素影響了中樞神經對正常腸道功能的生理調控，導致正常的內調節信號在中樞神經系統放大，產生異常感覺，從而導致腹痛等癥狀.寶寶樂顆粒由白芍、黃芪、大棗、桂枝、干姜、山楂、六神曲、麥芽等八味藥材組成.溫中補虛，和里緩急，開胃消食，用于脾胃虛寒，脘腹隱痛，喜溫喜按，胃納不香，食少便溏.供試品口服，一次5～10g，一日2～3次，故6～9歲兒童臨床最大使用劑量為30g/人/日，按70kg人和60g幼鼠等效劑量折算系數法可得幼鼠等效劑量為9.3g生藥/kg/d.幼鼠按臨床等效劑量1倍（A）、2倍（B）、4倍（C）設計3個劑量，即是10.0g生藥/kg/d、20.0g生藥/kg/d、40.0g生藥/kg/d.

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar幼鼠70只，SPF級，體重180～220g，購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司［合格證號：SCXK（吉）2016-0003］.

1.2 實驗藥品與試劑

寶寶樂顆粒［修正藥業集團股份有限公司，5g/袋］；P物質、5-羥色胺、腫瘤壞死因子α試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；乙醚（國藥集團化學試劑有限公司）；石蠟油（天津市華東試劑廠）.

2 實驗方法

2.1 造模方法

參照《中醫實驗動物學》和文獻報道［3］的綜合造模方法加以改進，具體如下：Wistar幼鼠70只，空白對照組10只，每天喂養維持飼料，自由飲水，其余幼鼠進行造模.造模過程分為兩大階段（均自由飲水）.第一階段為前6天，單日喂精煉豬脂2mL/200g，雙日喂飼甘藍l0g/200g；每日38℃溫水中游泳至疲勞；第二階段為7～21天，每日再加灌100%番瀉葉水浸液2mL/200g.

2.2 分組及給藥劑量

將造模成功的Wistar幼鼠50只，隨機分為5組，分為模型組、陽性藥物對照組（黃芪建中丸組）、寶寶樂顆粒低、中、高劑量組（10g生藥/kg/d、20g生藥/kg/d、40g生藥/kg），每組10只.從實驗第22d開始，空白對照組、模型組均給予等量純化水，給藥體積為10mL/kg/d，持續給藥14d.

2.3 檢測指標

（1）一般情況.在實驗過程中，觀察幼鼠外觀及活動情況，如精神萎靡、蜷臥、扎堆、反應遲鈍、皮毛枯槁散亂、肛周污濁、飲食減少，消瘦等表現.記錄給藥前、后攝食量和體重變化.

（2）內臟敏感性檢測［4］.檢測前24h禁食、不禁水.乙醚麻醉后，將用石蠟油潤滑的8F導尿管經肛門插入，氣囊末端距肛門1cm，將導尿管固定于大鼠尾部.大鼠蘇醒后，將其放在特制的塑料籠內，大鼠只能上下運動，無法前后活動和轉身.30min適應期后通過觀察不同的壓力（20mmHg、30mmHg、40mmHg）條件下的結直腸擴張刺激下的AWR評分，用來反映幼鼠內臟敏感性的變化.結直腸擴張（Colorectal Distention，CRD）刺激時，每個CRD壓力持續時間為20s，并且重復3次，最后取三次所測得的AWR評分的平均值，作為該擴張壓力下最終的腹壁回撤反射（AWR）得分［5］.

評分標準：0分，大鼠對結直腸擴張無行為學反應；1分，結直腸擴張時身體靜止不動，頭部運動減少或抬高；2分，結直腸擴張時腹肌收縮，但腹部未抬離桌面；3分，結直腸擴張時腹肌收縮且腹部抬離桌面，嘶叫；4分，結直腸擴張時骨盆抬起，身體呈弓形.

（3）血中致痛物質P物質（SP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、神經遞質5-羥色胺（5-HT）含量的測定嚴格按規定程序進行，取靜脈血3mL，注入含30uL 0.5M EDTA-Na2和抑肽酶1500KIU抗凝試管中混勻，離心，取血漿放-20℃保存備用，待測血漿中致痛物質P物質（SP）、神經遞質5-羥色胺（5-HT）含量；常規靜脈取血，分離血清，置-20℃保存備用，測定TNF-α水平.

2.4 統計分析

實驗數據用Excel統計分析，數據采用t檢驗，結果用均值±標準差表示，p＜0.05具有統計學差異.

3 實驗結果

3.1 一般情況

造模開始前，幼鼠皮毛潔白有光澤，精神狀態良好.造模后，精神萎靡、瞇眼、蜷臥、反應遲鈍、行走不穩、皮毛枯槁散亂、肛周污濁、飲食減少，消瘦等表現.各組給藥前后動物體重及攝食量變化未見明顯差異.詳見表1～2.

3.2 內臟敏感性評價

結果表明，模型組幼鼠在各個CRD壓力（20mmHg、30mmHg和40mmHg）刺激下的AWR評分與空白對照組比較明顯升高（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001）；寶寶樂顆粒低、中、高劑量可降低幼鼠在CRD壓力為20mmHg、30mmHg和40mmHg時的AWR評分，與模型組相比，差異具有統計學意義（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001）.詳見表3.

3.3 對血中致痛物質P（SP）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、神經遞質5-羥色胺（5-HT）含量的影響

結果表明，與空白對照組比較，模型組幼鼠血漿中SP、5-HT和血清中TNF-α含量明顯升高（p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001）；寶寶樂顆粒低、中、高劑量組幼鼠血漿中SP和5-HT含量降低，與模型組相比，差異具有統計學意義（p＜0.05，p＜0.01）；寶寶樂顆粒高劑量組幼鼠血清中TNF-α含量降低，與模型組相比，差異具有統計學意義（p＜0.05）.詳見表4.

4 討論

脾胃虛寒型功能性腹痛（FAP-NOS）發病機制尚未完全闡明，但腦-腸軸功能失調被公認為是其主要的發病機制之一.多種神經遞質的分泌異常影響胃腸道運動、感覺和分泌功能.實驗證實［6］，結直腸擴張刺激活化大腦多個區域一級邊緣神經系統并對壓力呈依賴性，使中樞性感覺高度敏感，加上后續反應引起胃腸功能失調.本研究結果表明，寶寶樂顆粒低、中、高劑量可降低幼鼠在CRD壓力為20mmHg、30mmHg和40mmHg時的AWR評分，降低胃腸道內臟敏感性，使得大部分的胃腸道平滑肌運動増強.SP作為重要的痛覺興奮性傳導遞質之一［7-8］，主要通過向上傳遞至中樞神經系統，也可逆向釋放入損傷局部組織中，啟動神經源性雙向可逆炎癥反應［9］，調節多種細胞產生各種細胞因子.Ansel［10］證實SP能促進肥大細胞釋放炎癥介質，刺激單核-巨噬細胞系統產生TNF-α；同時TNF-α還能刺激神經生長因子的合成和促進SP的釋放［11］.5-HT可作為重要的神經遞質，參與調節腦-腸軸的互動過程［12-13］，臨床研究發現功能性腹痛患者5-HT的合成、釋放和再攝取異常，可導致腸道感覺過敏和動力異常.本研究發現，脾胃虛寒型FAP-NOS模型鼠血漿5-HT水平明顯升高，這與國外Simon等［14］發現功能性腹痛患者血中5-HT含量升高的結果一致.本研究結果表明，寶寶樂顆粒可以調節神經遞質5-HT和SP的興奮性，降低致痛物質SP的釋放，刺激膽堿能神經元，其藥理作用呈量效關系.寶寶樂顆粒在其溫胃化濕行氣的基礎上佐以少量滋陰性寒的干姜，溫而不燥，從而達到調節腦-腸軸功能，從根本上解決改善機體虛寒證候［15］.

表1 幼鼠給藥前后體重變化表（s，n=10）

表2 對幼鼠攝食量的影響（s，n=10）

表3 各組幼鼠在不同擴張容量下AWR評分比較（s，n=10）

表4 對脾胃虛寒型幼鼠血漿中SP、5-HT和血清中TNF-α含量的影響（s，n=10）