原生態殼聚糖膜的結構與性能研究

邢曉露

(青島大學 紡織服裝學院，山東 青島266071)

殼聚糖是甲殼素部分或全部脫乙酰基的產物，化學名為β-(1-4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖[1]，廣泛存在于甲殼綱動物蝦和蟹的甲殼、昆蟲的甲殼、真菌的細胞壁和植物(如蘑菇)的細胞壁中，在食品、醫藥、農業、化妝品等方面具有廣泛的用途[2]。 殼聚糖因其良好的抑菌性、吸附性、生物相容性、生物降解性、可塑性、可修飾性等性能，近年來，在生物醫學工程領域特別是在醫用敷料、藥物載體、組織工程支架等方面取得突破性進展。 關于殼聚糖的結構性能，從上個世紀90 年代開始已經有了大量研究，但是大部分研究都是將蝦蟹殼看成是一個片狀材料，在應用時，也是將其粉粹后做溶解等處理，很少去關注蟹殼本身的微觀結構。 關于殼聚糖膜在醫學方面的應用研究，主要集中于將殼聚糖靜電紡絲制得膜[3]、凝膠化干燥制得膜[4]等，而不是直接制得殼聚糖生物膜。 本文以原生的梭子蟹和阿拉斯加雪蟹的殼為原料，從中提取出片狀殼聚糖生物膜，并對其結構和性能做了系統性研究。 原生態的殼聚糖膜天然、環保，具有獨特的結構且強力高，在用于骨組織工程、腦內膜、美容整形、仿生骨膜、防術后黏連膜等領域更具有優勢。

1 殼聚糖膜的制備及理化性能測試

1.1 試驗材料與試劑

梭子蟹殼；阿拉斯加雪蟹殼；鹽酸；氫氧化鈉；冰乙酸；氯化鈉；甲基橙—苯胺藍指示劑。

1.2 主要儀器和設備

SHZ-82 水浴恒溫振蕩器(金壇市天竟實驗儀器廠)，DPCSB-03 型多頻超聲波發生器(青島大學)，zh13101-2 型電熱鼓風干燥箱(山東張店電熱儀器廠)，PHS-2C 型酸度計(上海理達儀器廠)，箱式電阻爐(上海索域試驗設備有限公司)，NDJ-8S 旋轉粘度計(上海昌吉地質儀器有限公司)，烏氏粘度計(上海晶菱玻璃有限公司)，臺式電子掃描顯微鏡(phenom pro .Netheland)，TG 209 F3 Tarsus 熱重分析儀(德國耐馳儀器制造有限公司)，Rigaku Ultima X 射線衍射儀(Rigaku Corporation)。

1.3 制備方法

Benhabiles MS[5]等研究了不同反應條件下蟹殼中甲殼素的制備，得出脫鈣反應的條件在鹽酸溶液濃度1.5 N、時間30 min、溫度常溫、浴比1：15 為最佳，脫蛋白反應的條件在氫氧化鈉溶液濃度2 N、時間2 h、溫度45 ℃、浴比1 ∶20 為最佳；蔚鑫鑫[6]等研究了從小龍蝦中提取殼聚糖的工藝，得出最佳工藝條件為：采用室溫下1 mol/L 的鹽酸溶液浸泡24 h，用2 mol/L 的氫氧化鈉溶液在90℃～100℃反應4 h，用質量分數50 %的氫氧化鈉溶液于90 ℃中水浴3 h；Chae K S[7]等研究了蟋蟀中殼聚糖的提取，采取了如下工藝：用濃度為1 M 的氫氧化鈉溶液在95 ℃反應6 h，用草酸溶液在室溫下攪拌3 h，用質量分數為50 %～67 %的氫氧化鈉溶液在95 ℃條件下反應。 劉倫杰[8]用濃度為5 %的氫氧化鈉溶液在85 ℃下浸泡4 h，然后用濃度為3%的鹽酸溶液在30 ℃下浸泡了18 h，最后用濃度為40 %的氫氧化鈉溶液在90 ℃下處理12 h，從蠶蛹中提取出了殼聚糖。 結合上述文獻中探索出的實驗條件，經過試驗探索，形成以下工藝條件：

(1)將蟹殼洗凈，去除殼上的雜質、污垢，然后用超聲波發生器進行超聲洗滌，放入烘箱中60℃烘干并稱重。

(2)脫鈣反應：考慮到完整的蟹殼所占的體積和質量較大，以試劑能夠浸沒過試樣為準，并結合不同浴比得到的產率，將蟹殼按照1：25 的浴比浸泡于7 %的鹽酸溶液中，在室溫下浸泡16 h，進行脫鈣處理，然后用蒸餾水洗至中性，烘干、稱重。

(3)脫蛋白反應：將脫鈣后的蟹殼按照1：70的浴比浸泡于10 %的氫氧化鈉溶液中，將燒杯置于80 ℃下的水浴恒溫振蕩器中振蕩5 h，進行脫蛋白反應，即可得到甲殼素，然后用蒸餾水洗至中性，烘干、稱重。

(4)脫乙酰基反應：將甲殼素按照1：80 的浴比置于50 %的氫氧化鈉溶液中，120 ℃下加熱5 h，進行脫乙酰基反應，即可得到殼聚糖，然后用蒸餾水洗至中性，烘干、稱重。

1.4 理化性能測試

1.4.1 脫乙酰度測試

依據行業標準FZ/T 50037-2017 殼聚糖纖維脫乙酰度試驗方法，采取酸堿滴定法進行測試。

稱取0.2 g ～0.3 g 樣品，加入0.1 mol/L 標準鹽酸溶液30 mL，在常溫下攪拌至完全溶解后，加入2 滴甲基橙—苯胺藍指示劑。 滴入0.1 mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液，當溶液變為藍綠色時，即為滴定終點，讀取氫氧化鈉標準滴定溶液的滴定體積。 最后根據下列公式進行脫乙酰度計算：

式中：D 為脫乙酰度(%)；c1為鹽酸標準滴定溶液的物質的量濃度(mol/L)；V3為加入鹽酸標準滴定溶液的體積(mL)；c2為氫氧化鈉標準滴定溶液的物質的量濃度(mol/L)；V4為滴定所消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液的體積(mL)；m 為已測殼聚糖的質量(g)。

1.4.2 溶解性測試

將殼聚糖溶解于1 %的冰乙酸中，將未溶解的剩余物洗凈并烘干稱重，溶解的殼聚糖高聚物質量占原始質量的百分比即為溶解度。

1.4.3 灰分測定

依據KUMARI S[9]等測定灰分的方法，在坩堝中稱取2 g～5 g 殼聚糖樣品，放入電爐中于550 ℃灼燒3 h，取出，冷卻30 min，稱重。 再放入電爐中灼燒1 h，冷卻稱重，反復灼燒至恒重，計算樣品中的灰分含量：

式中：X 為樣品的灰分含量(%)；m1為坩堝與樣品的總質量(g)；m2為坩堝與灰分的總質量(g)；m3為灼燒至恒重時的坩堝質量(g)。

1.4.4 粘度測定

依據國家標準GB 29941-2013 食品添加劑 脫乙酰甲殼素(殼聚糖)，在室溫下稱取烘干至恒重的試樣3.0 g，加入到300 mL 水中，然后加入冰乙酸3.0 g，攪拌至試樣充分溶解，用旋轉式粘度計測定其粘度。

1.4.5 相對分子量測定

采用粘度法[2]測定殼聚糖的相對分子量，由特性粘度[η]來計算分子量。 稱取1 g 殼聚糖樣品，用0.1 mol/L 乙酸-0.2 mol/L 氯化鈉溶劑配成50 mL 樣品溶液，濃度為c1，將其倒入粘度計的粗管中，在25 ℃水浴中保溫10 min。 堵住粗管口，用吸耳球從細管口吸氣，使溶液逐漸上升至上刻度線以上，然后松開手指、移走吸耳球，使樣品溶液在細管內自然下落，記錄通過上下刻度線間的時間t1；然后量取5 mL 溶劑加入粘度計中，此時濃度為c2，時間為t2，再依次量取5 mL 和10 mL 溶劑分別加入粘度計中，濃度分別為c3和c4，時間分別為t3和t4，測定溶劑粘度時的時間為t0。 對應于各濃度的相對粘度[ηr]為：

增比粘度＝ηr-1，比濃粘度為ηsp/c。

將得到的4 個比濃粘度對濃度作圖，可得到一條直線，將直線延長至與縱坐標相交，截距即為特性粘度[η]。 根據Mark-Houwink 公式 η[ ] ＝K Ma可計算得到殼聚糖的分子量M。

1.5 殼聚糖膜的表征測試

1.5.1 截面及內表面形貌測試

將片狀殼聚糖膜沿著橫向和縱向切斷，切取橫向切片和縱向切片，每一個樣品都檢測其橫截面和縱截面，并直接檢測其內表面的形態，借助掃描電子顯微鏡，將樣品用導電膠粘到實驗圓臺上，做好標記，然后對其進行表面噴金，采用5 KV 的加速電壓進行檢測，在不同的放大倍數下觀察殼聚糖膜的微觀形貌。

1.5.2 結晶度測試

借助X 射線衍射儀，實驗采用銅靶，管壓為40 KV，管流為40 mA， 掃描的角度范圍為5 °-85 °，掃描速度為2 s-1。

1.5.3 熱穩定性測試

采用TG 209 F3 Tarsus 熱重分析儀對殼聚糖膜進行熱重分析，氮氣氣氛保護，溫度范圍為35 ℃-800 ℃，加熱速度為10 K/min。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖膜的理化性能

2.1.1 脫乙酰度

脫乙酰度的大小是衡量殼聚糖制備是否成功以及殼聚糖性能好壞的重要指標，直接影響到溶解度、粘度等性能，因此，殼聚糖脫乙酰度的測定極為重要。

根據脫乙酰度的計算公式，進行多次重復試驗后取平均值，得到梭子蟹殼聚糖的脫乙酰度為96.5 %，阿拉斯加雪蟹殼聚糖的脫乙酰度為81 %。在相同的實驗條件下，兩種殼聚糖的脫乙酰度均達到80 %以上，且梭子蟹殼聚糖較阿拉斯加雪蟹殼聚糖的脫乙酰度高，這說明制備殼聚糖膜時，不同的來源是影響脫乙酰度的一個重要因素。

2.1.2 溶解性能

殼聚糖的溶解性主要取決于其生物來源、分子量和脫乙酰度。

將殼聚糖膜溶解于1 %的冰乙酸中，發現沒有未溶解的剩余物，即殼聚糖膜全部溶解，溶解性能良好。

2.1.3 灰分

根據行業標準SC/T 3403-2004 甲殼質與殼聚糖，殼聚糖的理化指標的要求如表1 所示：

表1 殼聚糖的理化指標要求

根據公式計算得到如下結果：梭子蟹殼聚糖膜的灰分為1.5 %，阿拉斯加雪蟹殼聚糖膜的灰分為1.1 %，表明脫鈣處理時已去除了絕大多數的無機鹽，梭子蟹殼聚糖膜的灰分含量略高于阿拉斯加雪蟹殼聚糖膜的灰分，實驗測得的灰分含量均符合工業級殼聚糖的標準要求，但不能用于食品級殼聚糖的應用。

2.1.4 粘 度

粘度的大小反映了分子量的大小，不同粘度的殼聚糖具有不同的應用領域，對殼聚糖的成膜性及殼聚糖纖維的強度有較大影響。

在1 號轉子，轉速60 r/min 的條件下，旋轉粘度計測得的梭子蟹殼聚糖膜的百分計標度為27.6%，表明轉子和轉速的選擇是合適的，此時測得的殼聚糖大分子的粘度為27 mPa·s；阿拉斯加雪蟹殼聚糖膜的粘度為31.2 mPa·s，均屬于低粘度殼聚糖。

2.1.5 相對分子量

(1)梭子蟹殼聚糖膜

不同條件下測得的通過烏氏粘度計上下兩刻度線之間的時間t0-t4分別如表2 所示：

根據各濃度的相對粘度、增比粘度和比濃粘度，求得：

由此，回歸方程為： y^＝b0＋bx ＝2.373 ＋1.129x

檢驗方程的顯著性：

查F 分布臨界值表可知，F0.1(1，2)＝8.53＜F，故方程在α ＝0.1 時顯著。

當x ＝ 0 時， [ η] ＝ 2.373 × 100 mL/g＝237.3 mL/g

由Mark-Houwink 公式 η[ ] ＝K Ma，其中K ＝1.81×10-3，α ＝0.93，計算可得由梭子蟹殼制得的殼聚糖膜的分子量M＝3.18×105。

(2)阿拉斯加雪蟹殼聚糖膜

不同條件下測得的通過烏氏粘度計上下兩刻度線之間的時間t0-t4分別如表3 所示：

表3 雪蟹殼聚糖通過刻度線的時間

根據各濃度的相對粘度、增比粘度和比濃粘度，求得：

查F 分布臨界值表可知，F0.01(1，2)＝98.5＜F，故方程在α ＝0.01 時顯著。

當x ＝0 時，[η]＝3.06×100 mL/g ＝306 mL/g

由Mark-Houwink 公式 η[ ] ＝K Ma，其中K ＝1.81×10-3，α ＝0.93，計算可得由阿拉斯加雪蟹殼制得的殼聚糖膜的分子量M＝4.18×105。

(3)根據結果可知，由梭子蟹殼和阿拉斯加雪蟹殼制得的殼聚糖膜的分子量分別為3.18×105和4.18×105，阿拉斯加雪蟹殼聚糖膜的分子量略大。

2.2 殼聚糖膜的表征

2.2.1 表觀形貌

圖1 兩種殼聚糖的內表面電鏡照片

2.2.1.1 內表面形貌 兩種殼聚糖膜在300X 的放大倍數下的內表面形貌及局部放大圖像如圖1所示。

從圖1 中可以看出，殼聚糖膜表面有較小的旋渦狀孔洞，孔洞的大小因蟹殼種類的不同而有所差異，梭子蟹殼聚糖的孔洞排列較為規則且孔洞之間間距較小，孔洞的直徑也較小，約為15μm；阿拉斯加雪蟹殼聚糖的孔洞間隔較大，孔洞的直徑約為30μm，是梭子蟹殼聚糖的2 倍。 這些孔洞可能是蟹進行養料及水分輸送的通道。

2.2.1.2 橫截面 在7000X 的放大倍數下，梭子蟹殼聚糖和阿拉斯加雪蟹殼聚糖的橫截面形貌如圖2 所示。

圖2 兩種殼聚糖的橫截面電鏡照片

由圖2 可以看出，殼聚糖在蟹殼中呈層狀疊加結構分布，層與層之間間隔較緊密，且平行于截面。觀察到的總厚度約為15μm，層數為50 層左右，即每層的厚度約可達到300 nm，屬于納米級層狀殼聚糖生物膜。 在相同的放大倍數下，阿拉斯加雪蟹殼聚糖膜的層數更多，層與層之間的間隔也更加均勻。

2.2.1.3 縱截面 在7000X 的放大倍數下，梭子蟹殼聚糖和阿拉斯加雪蟹殼聚糖的縱截面形貌如圖3 所示。

由圖3 可以看出，殼聚糖膜的縱截面也呈層狀疊加結構，其內表皮層的厚度比橫截面的內表皮層略小，且層與層之間的間隔也較橫截面小。

2.2.2 結晶性能分析

采用Rigaku Ultima X 射線衍射儀對殼聚糖膜進行的X 射線分析如圖4 所示。

圖4 兩種殼聚糖的X 射線衍射圖像

Samuels[10]等研究了殼聚糖的兩種晶體形態，分別稱為Rorm I(2θ 在10 °左右)和Rorm II(2θ 在20 °左右)，均屬于單斜晶系。 從圖4 可知，制得的兩種殼聚糖膜都具有這兩種晶體形態，且顯示了非常強的結晶性，屬于α-殼聚糖。 阿拉斯加雪蟹殼聚糖膜在2θ ＝10.44 °和20.04 °的位置出現尖銳的衍射峰，梭子蟹殼殼聚糖膜的衍射峰出現在2θ ＝10.44 °和20.1 °的位置，位置較為接近，但阿拉斯加雪蟹殼聚糖膜的結晶度較高。

2.2.3 熱穩定性分析

兩種殼聚糖膜的熱重分析曲線如圖5 所示。

圖5 兩種殼聚糖的熱重分析圖像

圖5 的曲線反映了35 ℃～800 ℃的溫度范圍內，阿拉斯加雪蟹殼聚糖和梭子蟹殼聚糖質量的失重百分數和溫度的關系，從圖中可以看出，兩種殼聚糖的分解均發生在兩個階段。 第一階段為50 ℃～130 ℃，該階段殼聚糖失去結晶水；第二階段發生在270 ℃～320 ℃，該階段為主鏈斷裂的過程，最終分解溫度在700 ℃左右。 兩種殼聚糖的分解溫度基本接近，其中，阿拉斯加雪蟹殼聚糖的失重量略小于梭子蟹殼聚糖的失重量。

3 結 論

殼聚糖是一種天然高聚物，具有良好的抗菌性和生物相容性，本文研究了由阿拉斯加雪蟹殼和梭子蟹殼制得的殼聚糖生物膜的性能并進行比較，得到以下結論：

1)探索了制備殼聚糖膜的工藝條件：用7 %的鹽酸溶液在室溫下浸泡樣品16 h 后，用10 %的氫氧化鈉溶液在80 ℃下加熱樣品5 h，最后在50 %的氫氧化鈉溶液在120 ℃下高溫加熱5 h，即可得到脫乙酰度和溶解度較好的殼聚糖膜。

2)制備的原生態殼聚糖膜脫乙酰度良好，均在80 %以上，溶解度均為100 %，屬于低粘度殼聚糖，表面有旋渦狀的微小孔洞，截面為納米級層狀疊加結構，結晶性也較強。 兩種來源制得的殼聚糖膜性能基本接近，但阿拉斯加雪蟹殼聚糖膜的性能略好于梭子蟹殼聚糖膜。