1H-磁共振波譜成像診斷兔血吸蟲肝纖維化

王國光， 孟令平， 胡明秀， 洪玉萍， 官兵

肝臟寄生蟲感染是引起纖維化-肝硬化的原因之一，在東南亞包括中國，以日本血吸蟲感染最為多見，它既可以感染人類，也可以在動物身上出現[1]，曾經在全球多地區爆發流行，極大地損害了人類以及畜類動物的健康[2]。人體感染血吸蟲后，主要發病器官為肝臟及結腸，肝臟的慢性病理侵害是血吸蟲病引起臨床癥狀的主要原因，而且如果慢性血吸蟲性肝硬化晚期患者同時患上乙型肝炎，會導致肝細胞損害加劇，增加誘發肝癌的風險[3]。因此，積極預防、早期發現血吸蟲肝纖維化和肝硬化對有效治療血吸蟲病患者具有非常重要的意義。MRS(magnetic resonance spectrum，MRS)是目前唯一從分子水平反映組織生理代謝改變的一種無創性檢查技術，本研究主要討論血吸蟲性肝纖維化的1H-MRS波譜表現。

材料與方法

1.動物模型建立

選用健康新西蘭大白兔，雄性，清潔級，體重大約2～3 kg，共25只，動物生產單位河南百儀寧生物科技公司，動物飼養單位中國農業科學院上海市獸醫研究所松江實驗動物中心。標準方法飼養。實驗過程對動物的各項處置均符合動物倫理學標準。

實驗動物新西蘭大白兔隨機分為兩組，實驗組19只，采用經腹部尾蚴貼片法誘導血吸蟲肝纖維化，對照組6只，以不含尾蚴的去氯水進行空白處理。

2.磁共振檢查

模型成功建立后，分別于第6周、第9周隨機選擇實驗組大白兔5只、空白組2只，第12周實驗組大白兔8只、空白組2只行磁共振檢查。

腹腔注射，麻醉劑為10%水合氯醛，用藥劑量4～5 mL/kg，麻醉深度：角膜反射遲緩、肢體肌力明顯下降，嗜睡狀態。受試兔采取仰臥位，四肢固定于特制木板上(防止受試兔中途醒來或肢體亂動造成運動偽影)；同時腹部采用棉紗布包裹及用病服覆蓋(防止受試兔在檢查過程中由于磁共振機房溫度較低而死亡)。

檢查儀器為荷蘭Philips Achieva 1.5T超導型磁共振成像儀，呼吸門控，線圈選用本單位的常規人體膝關節掃描的8通道體部相控陣表面線圈。受試兔仰臥固定于檢查板上位，將檢查板置于線圈內，上腹部位于中心，掃描范圍為膈頂到雙腎下極。

行肝臟常規MRI及MRS檢查。MRS：采用PRESS序列，掃描參數：TR 2000 ms，TE 144 ms，層厚5 mm，視野15 mm×15 mm，體素4 mm×15 mm(AP×RL)，激勵次數16次。首先選取常規MRI序列進行肝臟三平面掃描，選擇最合適的層面及檢查區域，一般在肝左葉上方層面放置興趣區(region of interest,ROI)容積，興趣區約10 mm×10 mm×10 mm，盡量選擇肝臟實質中間區域，遠離肝臟及肝裂，避開較大的血管及膽管，也不能太過靠近肝臟邊緣，會受到皮下脂肪和腸管的影響。首先進行預掃描，在ROI周圍放置飽和帶，降低周圍組織的影響；預掃描結束后，利用PRESS序列對選定的體素進行1H-MRS檢查。

3.病理檢查

磁共振檢查完成后，于病理科過量麻醉實驗大白兔，剖腹取出新鮮肝臟標本，測量大小并記錄，然后標本固定。根據MRI波譜檢查選取的感興趣區進行肝臟取材制作標本切片，行HE染色、網狀纖維染色、Masson染色。

由1位病理科醫師及1位病理科主任醫師采用雙盲法，觀察顯微鏡下肝細胞有無細胞壞死，肝血竇及匯管區的結構，血吸蟲蟲卵結節，纖維組織間隔增生情況，假小葉生成情況等。按組織病理學進行肝纖維化分級[4]，共分5級。S0：無纖維化。S1：匯管區周圍纖維化，星芒狀纖維，局限竇周纖維化或小葉內纖維瘢痕，仍存在完整的肝小葉。S2：可以見到纖維間隔形成，即橋接纖維化，主要由橋接壞死發展而來，雖有纖維間隔形成，但是小葉結構大部分仍保留。S3：可以見到大量纖維間隔形成，分隔并破壞小葉，導致小葉結構混亂，但未見到明顯的假小葉，此期可出現門脈高壓和食管靜脈曲張。S4：早期肝硬化期，彌漫性纖維增生，大部分肝小葉被破壞，被分隔的肝細胞團呈不同程度的再生和假小葉形成。此期炎癥多尚在進行，纖維間隔寬大疏松，改建尚不充分。這與肝硬化不同，在肝硬化時，纖維包繞于假小葉周圍，間隔內膠原及彈力纖維經改建，多環繞假小葉呈平行排列。

4.數據采集

常規MRI圖像采用雙盲法進行診斷，由2名高年資的、具有豐富的MRI影像診斷經驗的主治醫師閱片，并對實驗組和空白對照組所有兔的T1WI、T2WI序列圖像的肝臟形態變化、信號特點及其他相關并發癥做出診斷分析。

獲取1H-MRS原始圖像后，在Philips工作站上利用軟件程序進行后處理，使1H-MRS波譜圖像基線平穩，得到3個代謝物的波峰：水峰(H2O)、膽堿峰(Cho)及LIP 峰，水峰定位于4.6～4.7 ppm，膽堿峰定位于3.2～3.3 ppm，脂質峰則是位于1.3～1.44 ppm處。通過后處理軟件獲取水峰(H2O)、膽堿峰(Cho)及LIP峰的峰值數據，以及水峰下面積、Lip峰下面積的數據，峰下面積可以代表代謝物的濃度；用Microsoft office Excel 2007搜集數據，并計算脂肪分數(fat fraction)，脂肪分數=Lip峰下面積/(Lip峰下面積+Water峰下面積)×100%。

圖1 肝病理切片，HE染色(4×100)。a) 對照組S0期； b) 實驗組S1期； c) 實驗組S2期； d) 實驗組S3-4期。

5.統計學分析

使用SPSS 20.0統計學軟件包對數據進行統計學處理。首先對1H-磁共振波譜數據結果采用方差齊性檢驗及正態性檢驗(單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗)，對符合正態分布的數據結果采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為有統計學意義；與血吸蟲性肝纖維化病理分級相關性，進行Pearson相關分析。對不符合正態分布的數據結果用中位數(四分位數)表示，采用非參數檢驗(Kruskal-Wallis檢驗)分析。與血吸蟲性肝纖維化病理分級相關性，采用Spearman相關分析。

結 果

1.血吸蟲肝纖維化模型的建立結果

實驗大白兔感染血吸蟲后，隨著實驗時間延長，病情進展，病兔體格消瘦，毛發紊亂，色澤發黃，食欲較差，精神不振；實驗組兔(n=18)于第9周末死亡1只，死亡率為1/18。正常對照組兔全部存活(n=6)，精神狀態可，體格健壯，毛發光澤，食欲可，未及其他癥狀。

2.病理學檢查結果

對照組6例，新西蘭大白兔實驗組病肝共18例，其中S1期(輕度肝纖維化)5例，S2期(中度肝纖維化)7例，S3-4期(重度肝纖維化及早期肝硬化)6例(圖1)。

3.MRS波譜分析結果

所有1H-MRS譜線均可以看到在4.6～4.7 ppm處出現一高尖的水峰(H2O)，清晰顯示肝臟H2O峰及其峰下面積，同時在1.3～1.4 ppm處可以看到一低矮的脂質峰(Lip)，脂質峰及其峰下面積顯示也比較清晰，部分譜線還可以在3.2～3.3 ppm處看到一低平的膽堿峰(Cho)。

健康對照組6例，5例得到成功1H-MRS譜圖(圖2a)；實驗組大白兔18例，共得到肝臟1H-MRS波譜圖像15例，其中S1期有5例(圖2b)，S2期有6例(圖2c)，S3～4期有4例(圖2d)。

通過后期處理軟件計算得到水峰(H2O)、膽堿峰(Cho)及Lip峰峰值以及波峰下面積的數據，并計算脂肪分數(fat fraction，表1～4)。

隨著血吸蟲性肝纖維化的進展，1H-MRS波譜水峰(H2O)峰值呈下降趨勢(P<0.05)，二者呈輕度負相關，相關系數r=-0.615 (P<0.05)，其中S0期與S2及S3期差異明顯(P<0.05)；其余各期之間無顯著差別(P>0.05)。水峰(H2O)下面積亦呈下降趨勢，r=-0492 (P<0.05)，其中S0期與S3～4期差異較顯著(P<0.05)，其余各期之間無顯著差別(P>0.05)。膽堿峰(Cho)呈上升趨勢(P<0.05)，與血吸蟲肝纖維化分期呈輕度正相關，相關系數為r=0.528(P<0.05)。血吸蟲肝纖維化實驗組脂質峰(Lip)、脂質峰(Lip)下面積、脂肪分數及Cho/Lip與對照組差異不明顯(P>0.05)，但脂質(Lip)峰下面積呈輕度上升趨勢，與血吸蟲肝纖維化分期呈輕度正相關，相關系數r=0.615(P<0.05)。

圖2 1H-MRS圖譜。a) 對照組S0期； b) 實驗組S1期； c) 實驗組S2期； d) 實驗組S3-4期。

表1 兔血吸蟲肝纖維化模型1.5T 1H-MRS結果定量分析

注：P<0.05為統計結果有意義。符合方差齊性與正態分布，采用單因素方差分析(P<0.05)。

表2 兔血吸蟲肝纖維化模型1.5T 1H-MRS結果定量分析中位數(四分位數)

注：P<0.05為統計結果有意義。符合正態分布，但不符合方差齊性，采用Kruskal-Wallis 檢驗分析(P<0.05)。

討 論

血吸蟲性肝纖維化-肝硬化的發展是一個長期漸進的過程，目前早期治療效果較好，而晚期血吸蟲性肝硬化期難以逆轉，對患者肝臟功能造成損害[5]。迫切需要一種可靠、無創傷性的、具有良好可重復性的方法來評價和觀察血吸蟲肝纖維化的進展、轉歸以及藥物治療效果。

Orlacchio等[6]研究發現丙型肝炎患者采用3T磁共振進行1H-MRS檢查，肝內代謝物的變化與病理對照結果具有高度一致性，所以，Orlacchio等認為MRS可以代替肝臟穿刺活檢，準確評估肝纖維化的分級。MRS屬于磁共振功能成像技術，是采用磁共振現象和化學位移作用，利用射頻脈沖激勵被檢物質的原子核，再將獲得的含有特別信息的磁共振信號經傅立葉函數變換，以波形的樣式在化合物固定的頻率位置上顯示出來的成像技術。它可以定量分析某些特定的原子核及其化合物，在不損傷機體的前提下研究反應活體生物組織生理代謝并在細胞水平上檢測能量代謝變化[7]，使醫學影像學不再局限于單純的大體形態診斷，在細胞分子水平反映功能代謝的研究有了很大的發展[8-10]。目前，主要有1H、31P、19F、23Na、3He、39K、14N、13C等原子核應用于MRS的研究，1H在人體內天然豐度最高，不需要再引入外源性代謝物，并且可與常規MRI檢查共享相同的裝置，因此1H-MRS的臨床研究及臨床應用最廣泛。目前在神經系統特別是腦部的腫瘤檢查應用中最多見，在慢性肝病以及惡性腫瘤的診斷研究、反映肝臟疾病治療效果中的應用也越來越廣泛。本實驗采用PRESS序列，單體素技術進行1H-MRS檢查。Miriam等[11]研究發現屏氣狀態下與采用呼吸門控方式進行1H-MRS得到的波譜結果無明顯差異，兩者具有高度的一致性。有文獻報道[12]，3.0T MR的信噪比較1.5T MR顯著提高，但由于動物腹部呼吸和胃腸道氣液體等因素的影響，3.0T MR會出現更明顯的運動偽影和磁敏感偽影，導致圖像顯著失真變形。本研究利用1.5T MR采用呼吸門控式1H-MRS對所有大白兔進行檢查。

表3 1.5T 1H-MRS結果與肝纖維化分級相關性

注：采用Pearson相關分析，P<0.05為統計結果有意義。

表4 1.5T 1H-MRS結果與肝纖維化分級相關性

注：采用Spearman相關分析，P<0.05為統計結果有意義。

本研究主要測定新西蘭大白兔1H-MRS 譜線上的水峰(H2O)、膽堿峰(Cho)和脂質峰(Lip)。其中水峰(H2O)可以反映肝細胞內外水的代謝情況；膽堿峰(Cho)通過檢測肝細胞膜磷脂化合物的代謝水平，可以反映細胞增殖狀況；脂質峰(Lip)可以觀察、檢測肝臟局部組織內脂質代謝的變化情況。

本研究1H-MRS結果顯示血吸蟲性肝纖維化組水峰的峰值、峰下面積與正常對照組差異較大。血吸蟲病的基本病變是由蟲卵在組織中沉積所引起的蟲卵結節。在肝臟感染血吸蟲病早期，蟲卵內的毛蚴可以產生大量可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigen,SEA)，機體受到SEA的刺激，引起機體急性炎癥反應，形成炎性肉芽腫[13]。肉芽腫中央為蟲卵，蟲卵外環繞炎性細胞，多數為嗜酸性細胞，周圍有新生肉芽組織包裹，形成急性蟲卵結節，所以肝臟內水的代謝變化不大。隨時間進展，蟲卵內的毛蚴進入凋亡期，崩解并鈣化，周圍有較多類上皮細胞，異物巨細胞和淋巴細胞浸潤包繞，類似結核干酪樣壞死，壞死蟲卵被肉芽組織包裹，形成慢性蟲卵結節，最后結節發生纖維化。隨著肝纖維化的進展，星狀細胞(HSC)活化[14]變為成纖維細胞，產生大量膠原纖維并逐步沉積于肝組織，肝小葉重構、假小葉形成，壓迫肝血竇[15]；同時肝竇區域的內皮下基底膜形成，誘導肝竇向毛細血管轉化，致使肝竇的滲透減壓功能受損；肝硬化結節期出現新生及不成對血管，蟲卵阻塞靜脈分支形成較多閉塞血管，導致肝臟實質微循環穩態受損、肝實質血流灌注下降；由于肝內門靜脈匯管區周圍纖維組織增生, 使門靜脈分支管壁毛糙增厚，門靜脈血流灌注下降，等一系列因素導致肝纖維化晚期肝內水分子含量減低[16,17]。

王秋實等[18]研究發現隨著肝纖維化的進展，膽堿峰(Cho)峰值逐漸升高，本研究的結果與其相一致。在S0期及S1期的肝臟1H-MRS譜形中幾乎見不到膽堿峰，僅能用后處理軟件默認測量3.2～3.3ppm處峰值。膽堿峰代表了肝臟內肝細胞膜磷脂類代謝物的水平，可以有效地反映當前狀態下肝臟內細胞增殖的水平。在正常對照組中，肝細胞新陳代謝處于正常水平，肝細胞膜磷脂代謝處于一個平穩水平，所以幾乎檢測不到膽堿峰；而在血吸蟲肝病早期，以急性蟲卵結節形成為主，肝細胞變性壞死較為少見，并無異常肝細胞膜磷脂代謝，所以很少能檢測到膽堿峰。而在肝臟纖維化中后期，肝細胞發生變性壞死，小葉結構破壞，膠原纖維增生，假小葉形成，在此過程中，肝細胞新陳代謝旺盛，細胞增殖能力提升，對能量儲存、利用逐漸增加，所以可見檢測到明顯的膽堿峰。

肝臟在機體脂肪成分的新陳代謝過程中擔任著非常重要的角色，是脂類合成、轉運和消耗的工廠。所以肝臟內脂質代謝的過程深受肝臟功能狀態的影響。近年來，肝臟1H-MRS的研究越來越多，但是慢性肝臟纖維化病變進程中脂質的變化情況目前還留存著很多爭議，肝臟脂質含量的變化與肝纖維化分級是否存在相關性眾說紛紜。王秋實等[18]研究發現隨著肝纖維化的進展，脂質峰(Lip)峰值逐漸降低。王六紅等[19]研究認為在慢性肝纖維化病變的發展進程中，1H-MRS 脂質波峰的變化是一個比較復雜的過程。Cho等[20]研究發現，健康肝臟的脂質波峰峰高明顯高于慢性肝病，但隨著肝病的進展，慢性肝病后期肝內脂質的含量反而呈上升趨勢。周麗鳳等[21]研究發現正常對照組的脂質峰與早期肝硬化患者之間存在差異，主要是因為隨著肝硬化的進展肝細胞受損，肝小葉結構破壞，肝細胞會出現不同程度的水腫、變性以及脂肪浸潤，對脂肪的代謝功能受到影響。

本研究發現實驗組大白兔血吸蟲性肝纖維化期脂質峰高低于健康對照組，而脂肪分數隨著血吸蟲性肝纖維化的病程進展而呈上升趨勢(P>0.05)。本研究認為在肝臟感染血吸蟲早期，主要病變是急性蟲卵結節的形成，肝臟內脂質代謝功能未受明顯影響。而受急性炎癥的影響，肝臟腫大，質量增加，所以相應體素內肝臟含量相對減少，所以1H-MRS 脂質波峰在血吸蟲肝病早期會輕度下降。但隨著血吸蟲肝纖維化的發展，蟲卵沉積在肝內有分布差異，血吸蟲肝纖維化進程在肝內并非同步進行，所以血吸蟲肝臟內脂肪代謝功能的變化有較大的差異；同時肝內脂肪信號會受到蟲卵結節鈣化的影響，感興趣區的選擇不能避開鈣化的影響，所以1H-MRS 脂質波峰的變化會出現不同的結果。

目前肝臟1H-MRS的臨床研究和應用已經取得了巨大進展，但是仍然存在很多問題：(1)檢查時間都比較長, 受呼吸運動影響較大，不同病變波譜成功率不一致。(2)信噪比(SNR)比較差，數據后處理過程較為復雜。但是隨著MRI/MRS硬件的改進、軟件功能的完善及臨床研究的深入發展，MRS檢查時間進一步縮短，SNR提高，MRS的可信度會越來越高。MRS作為一種可以無創性檢測活體機體組織及細胞內部生化信息的功能成像檢查技術，有著廣闊的發展空間。