潑河水庫底泥中細(xì)菌群落的調(diào)查

田海軍，付朝輝

（信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南省漁業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，河南 信陽 464000）

湖泊生態(tài)系統(tǒng)在全球及區(qū)域地球化學(xué)循環(huán)中都發(fā)揮著重要的作用，而細(xì)菌作為有機化合物的主要分解者，調(diào)節(jié)水體環(huán)境，實現(xiàn)水質(zhì)的凈化，并在一定程度上反應(yīng)水體污染特征及其生態(tài)功能演變，因此細(xì)菌在湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的作用日益受到重視，研究細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，對了解群落結(jié)構(gòu)間的動態(tài)變化及生態(tài)功能、闡明群落與環(huán)境，功能間的具體聯(lián)系以及維護湖泊生態(tài)環(huán)境具有重要意義，同時也為水產(chǎn)品的安全養(yǎng)殖提供參考[1]。隨著分子生物學(xué)的理論與技術(shù)的發(fā)展，本研究將從分子水平上利用16S rRNA基因文庫技術(shù)分析研究潑河水庫底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特點[2]。

潑河水庫地處大別山北麓，坐落在淮河水系右支潑陂河上，在大別山北麓由深山向淺山丘陵地區(qū)延伸的過渡地帶，距光山縣潑陂河鎮(zhèn)3km，流域面積達到222km2，總庫容2.35億m3。潑河水庫地理位置獨特，南北分別距新縣、光山縣城各25km，潑河水庫風(fēng)景區(qū)地，集豫南山水田園風(fēng)光于一身，風(fēng)景區(qū)內(nèi)林木蔥郁，層巒疊翠，綠樹成蔭，多為天然次森林和人工林及散生亞熱帶經(jīng)濟林，潑河水庫漁業(yè)資源豐富，目前已發(fā)現(xiàn)有20余種經(jīng)濟魚類，景區(qū)自然景觀與人文景觀相映成趣，是難得的自然、生態(tài)旅游和休閑度假好去處。

潑河水庫氣候處于秦嶺淮河氣溫分界線上，屬亞熱帶向暖溫帶過渡區(qū)，氣候溫暖，四季分明，陽光充足、雨量充沛、植被茂盛。水庫流域上游山巒起伏連綿、峰高谷深、河溪交錯。風(fēng)景區(qū)內(nèi)林木蔥郁，層巒疊翠，綠樹成蔭，多為天然次森林和人工林及散生亞熱帶經(jīng)濟林。森林覆蓋率達75%。野生鳥類有貓頭鷹、啄木鳥、山雞、野鴨、白鷺等二十余種，野生動物有黃羊、野豬、野兔、刺猬和松鼠等，主要特產(chǎn)有茶葉、板栗、銀杏、蓮子和山野菜。潑河水庫漁業(yè)資源豐富，目前已發(fā)現(xiàn)經(jīng)濟魚類有30多種，除花鰱、白鰱、青魚、草魚四大家魚外，還有鯽、鯉、黑魚、桂魚、銀魚、武昌魚等，主要商品魚類為花鰱、白鰱、鯽、鯉和蒙古紅鲌，其中野生魚類黃尾鲴為水庫獨特商品魚類。

潑河水庫流域面積廣闊，春夏季氣候溫暖濕潤，儲藏豐富的魚類資源，盛產(chǎn)淡水魚類，種類、數(shù)量頗多。水底存在大量豐沃的底泥，為研究細(xì)菌群落的多樣性提供絕佳地點。水質(zhì)對于魚的生長至關(guān)重要，而底泥中的微生物對水質(zhì)的變化有舉足輕重的作用且細(xì)菌群落參與自然界物質(zhì)循環(huán)和能量流動，因此研究潑河水庫底泥中細(xì)菌群落的多樣性和豐富度就尤為重要。

1 材料與方法

1.1 樣品底泥的采集

材料為潑河水庫在2017年5月份和9月份以及2018年3月份三次在潑河水庫底泥，分別為下圖1中1#、2#、3#即從上游到下游的三處位置，所有的采樣點均使用定位系統(tǒng)GPS進行定位，2017年5月份和9月份以及2018年3月份在潑河水庫從上游到下游使用采泥器采集水庫表層底泥，另外每個采樣點同時采集3個平行底泥樣品，然后放在干凈的聚乙烯薄膜袋里等待測試[3]。

圖1 潑河水庫底泥樣品采樣點Fig.1 Sampling point of mud samples from Pohe Reservoir

1.2 實驗方法

1.2.1 底泥樣品中細(xì)菌總DNA的提取及16SrRNA基因PCR擴增

先完成基因組DNA的抽取，之后利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，按照指定的測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。PCR采用ABI GeneAmp9700型，全部樣品按照正式實驗條件進行，每個樣品3次重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%的瓊脂凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂電泳檢測。

1.2.2 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性改變，一次可以對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定[5]。將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合。連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板的富集，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。由美吉生物科技公司上機測序，得出數(shù)據(jù)報告，繼而進行后續(xù)分析。

表1 潑河水庫各采樣點自然概況Tab.1 Natural overview of each sampling point in Pohe Reservoir

2 結(jié)果與分析

2.1 測序情況和多樣性指數(shù)

OTU（Operational Taxonomic Units）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或者群體遺傳學(xué)研究中，為了便于分析，人為的給某一個分類單元設(shè)置同一個標(biāo)志，表2中的1-1#、1-2#、1-3#，分別代表第一次采樣的 1 號、2 號、3號點，然后以此類推分別是第二次、第三次的采樣點[6]。該指數(shù)實際反映了本次測序結(jié)果是否代表樣本的真實情況，由表2可知，Coverage數(shù)值較高都在90%以上，Shannon是香濃指數(shù)用來估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)之一[7]。它與Simpson多樣性指數(shù)均為常用的反映微生物多樣性的指數(shù)，Simpson是辛普森指數(shù)來估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)之一，在生態(tài)學(xué)中常用來定量的描述一個區(qū)域的生物多樣性。從本表中看到辛普森指數(shù)較低說明測試樣品中微生物群落多樣性比較高。

圖2 潑河泥香濃指數(shù)Fig.2 Sprinkling incense index

Shannon指數(shù)用于反應(yīng)樣品中微生物群落的多樣性（圖2），受樣品群落中物種豐富的和物種均勻度的影響，Shannon數(shù)值越大，就越表明樣品中物種越豐富，Shannon指數(shù)越小，則表明樣品中物種豐富度越低。如圖2所示，當(dāng)隨機抽取的測序條數(shù)大于5000時，Shannon指數(shù)走勢平穩(wěn)，表示其測序得到的數(shù)據(jù)以及物種覆蓋面足夠，基本能反應(yīng)出樣品中微生物的基本信息[8]，而且通過表2的Shannon指數(shù)可以直觀的看出，在不同的樣品中底泥細(xì)菌的多樣性：3-3#＞1-1#＞3-1#＞2-1#＞2-3#＞2-2#＞3-2#＞1-2#＞1-3#。

2.2 群落結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析

為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，本研究采用了RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU序列進行分類學(xué)分析得出群落結(jié)構(gòu)圖（表3），在這個表中為了研究方便將上面表1由屬的水平進一步合并到目的水平。由表3可知，一共有67個目，其中Others代表將其他比較少的目合并成一個目。由表2可知，在不同的樣品中各種目的細(xì)菌所占的比例，12個樣品物種組成共覆蓋45種，其中厭氧繩菌目Anaerolineaceae_uncultured，黃單胞菌目Xanthomonadales_uncultured為優(yōu)勢種群。

圖3的柱形圖是將表2的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成柱形圖，從中可以直觀的不同的底泥樣品中不同種類的細(xì)菌所占的比例。

表2 測序情況和多樣性指數(shù)表Tab.2 Sequencing and diversity index tables

表3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析表Tab.3 Analysis of bacterial community structure

續(xù)表3

圖3 群落結(jié)構(gòu)柱形圖Fig.3 Community structure column chart

圖4 OUT分布韋恩圖Fig.4 Venn diagram of OUT distribution

2.3 底泥細(xì)菌季度差異情況分析

Venn圖用于統(tǒng)計樣品間所共有以及獨有的OTU數(shù)目，由圖4可以直觀的比較出樣品中OTU數(shù)目組成的相似性以及重疊情況。現(xiàn)在以不同季度在細(xì)菌科的分類水平上進行分析，2017年5月樣品中共檢測到210個物種，其中特有的物種有5種；2017年9月份共檢測出217個物種，其中特有物種12種，和2017年5月份共有的物種一共197種；2018年3月樣品中共檢測出226種，和2017年9月份共有的物種一共有200種。同時也可以看出在這三個不同的時間段內(nèi)共有的物種有192種，其中第一次和第二次和第三次所特有的OTU數(shù)目分別為5、12、18，第三次采樣的底泥中特有的OTU最多，預(yù)示著有比較多的特有細(xì)菌。

2.4 底泥細(xì)菌空間差異分析

圖5是將三次采樣同一個位點的放在一起，來分析同一個采樣點在不同的時間段里細(xì)菌種類組成的特點。由圖5可知1#采樣點和2#采樣點在三個不同的時間段內(nèi)共有的細(xì)菌種類有201種，1#采樣點特有細(xì)菌種類16種，2#采樣點特有種類12種，3#采樣點特有細(xì)菌種類10種，三個采樣點共有細(xì)菌種類189種。2.5 理化指標(biāo)分析

典范對應(yīng)分析方法主要是用于環(huán)境變量和物種帆布關(guān)系的解析，能很好地幫助我們研究由定性變量的交互匯總表來揭示變量間的聯(lián)系[10]，交互表的信息以圖形的方式展示。常用于多個類別的定類變量，可以揭示同一個變量的各個類別之間的差異，以及不同變量各個類別之間的對應(yīng)關(guān)系，多用于兩個或者多個定類變量。

可以從各個采樣點的中心點向任意的一項理化指標(biāo)所在的向量做垂線，例如如果從圖6所有的9個采樣點做垂線到SD所在的向量，可以看出垂點越靠近SD（透明度）向量正方向的表示這個采樣點和 SD 的相關(guān)性越強，分別是 2-2#＞1-2#＞3-2#＞2-1#＞1-1#＞1-3#＞3-3#＞2-3#＞3-1#，另外從各個向量的夾角來看，當(dāng)從中心向任意兩個點做向量的時候，如果夾角是銳角的話那就表示這兩個指標(biāo)具有相關(guān)性，銳角越小說明相關(guān)性越大，如pH和T的夾角是銳角，而且角度比較小那么說明這兩個指標(biāo)是具有相關(guān)性的，同樣T和DO夾角是銳角也有比較強相關(guān)性，而SD和TP（總磷）在圖中可以看到夾角為鈍角，那么說明SD和TP這兩個指標(biāo)之間沒有相關(guān)性，第三從各個指標(biāo)距離中心點的位置看，越靠近中心，越?jīng)]有特征，越遠離中心，說明特征越明顯，從圖中可以看到TP距離中心點最遠，說明TP特征最強也就是說TP對這九個采樣點最重要，而COD（化學(xué)需氧量）距離中心最近說明COD在這9個樣品中特征不明顯。

3 討論

底泥微生物群落是湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是促進生態(tài)養(yǎng)殖系統(tǒng)新陳代謝的重要參與者，底泥細(xì)菌的存在對于凈化水體，改良池底生態(tài)環(huán)境，疾病防控等方面都具有重要的作用。我國目前對底泥中細(xì)菌的研究也不多。研究底泥細(xì)菌的情況，對了解底泥細(xì)菌的組成和種類分布，了解群落結(jié)構(gòu)間的動態(tài)變化及生態(tài)功能，維護湖泊生態(tài)環(huán)境具有積極意義。潑河水底存在大量豐沃的底泥，為研究細(xì)菌群落的多樣性提供絕佳地點。水質(zhì)對于魚的生長至關(guān)重要，而底泥中的微生物對水質(zhì)的變化有舉足輕重的作用且細(xì)菌群落參與自然界物質(zhì)循環(huán)和能量流動。不同時間段由于湖泊生態(tài)系統(tǒng)的選擇作用，潑河水庫底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是有變化的。

（1）從潑河水庫樣品的測序情況來看，所有樣品的香濃指數(shù)都比較高，辛普森指數(shù)都較低，這些共同說明了潑河水庫在2017年5月、9月和2018年3月時間段內(nèi)潑河水庫底泥中細(xì)菌群落具有很高的多樣性細(xì)菌的群落組成很豐富。

（2）潑河水庫底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成在檢測的三個時間段內(nèi)是有較大差異的，在2017年5月采樣的樣品中特有的物種有5種所占樣品中比例為5%，2017年9月份特有物種12種所在樣品中比例為4.8%，2018年3月特有物種13種所占比例7.3%，說明在不同的時間段內(nèi)潑河水庫底泥細(xì)菌群落發(fā)生了演替。在時間分布上，潑河水庫底泥細(xì)菌群落數(shù)量最高值出現(xiàn)在2018年3月份，最小值出現(xiàn)在2017年5月份，而在王曉丹等[11]在北京密云山水庫的研究中，7月份細(xì)菌總數(shù)達到最大值，這可能是受到研究水域的緯度和其它物理因素的影響，另一方面，可能是水庫生態(tài)環(huán)境的不同以及細(xì)菌種類差別導(dǎo)致了群落數(shù)量最高值出現(xiàn)時間的差別。

（3）從典范對應(yīng)分析中得知，潑河水庫中的DO和T、T和pH、DO和TP，指標(biāo)之間具有相關(guān)性且關(guān)系密切互相影響，而SD和COD指標(biāo)之間相互關(guān)系最弱幾乎沒有，最后TP是對細(xì)菌的組成最重要的指標(biāo)。錢瑋等研究發(fā)現(xiàn)總氮（TN）、總磷（TP）、總有機碳對太湖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大，其次是總磷（TP）和總有機碳（TOC）[12]。

（4）研究發(fā)現(xiàn)，在2017年5月、9月和2018年3月三次采樣三個時間段內(nèi)在科的分類水平上共有192種細(xì)菌，所占比例為77.4%，說明潑河水庫中至少七成的細(xì)菌是長期固定不變的。這說明潑河水庫底泥擁有穩(wěn)定的特性，考慮到底泥細(xì)菌生活的特殊環(huán)境，即遠離表層水體，以及水深程度的相關(guān)因素，底泥細(xì)菌生長環(huán)境遠離表層，不容易受到水體水質(zhì)變化的影響。潑河水庫3個采樣點12個樣品物種組成共覆蓋45種，其中厭氧繩菌目Anaerolineaceae_uncultured，黃單胞菌目Xanthomonadales_uncultured為優(yōu)勢種群。成敏玲研究東湖不同富營養(yǎng)化區(qū)域底泥的優(yōu)勢種群，官橋湖區(qū)為脫氯單胞菌屬Dechloromonas、Desulfatiglans和硫桿菌屬 Thiobacillus，海洋世界區(qū)為硝化螺菌屬Nitrospira[13]。曲艷嬌等于2009至2010年對海浪河河夾村段水體及底泥中細(xì)菌組成與時空分布進行研究，結(jié)果表明，該流域分離出的細(xì)菌隸屬于5個細(xì)菌菌屬，其中微球菌屬Micrococcus是優(yōu)勢菌屬，其次是假單胞菌屬Pseudomonas和動膠菌屬Zoogloeaitzigsohn[14]。張東升等對碧流河水庫2008年4—11月水體細(xì)菌生物量為（4.94±2.37）mg·L-1，細(xì)菌密度最高值出現(xiàn)在 5月份下游右側(cè)中層，細(xì)菌數(shù)量水平、垂直分布無規(guī)律[15]。厭氧繩菌、黃單胞菌、硫桿菌屬為革蘭氏陰性，厭氧菌數(shù)量較多，說明含氧量低不利于好氧細(xì)菌的生長和繁殖，不能進行光合作用的菌屬，因為底泥一般在水中較深處，陽光無法照射，在有合適的無機電子供體時，能同化有機物，同時可以降低亞硝酸鹽，硫化氫含量，分解有機物，可作為無機營養(yǎng)菌。潑河水庫存在大量淡水魚類，潑河水庫漁業(yè)資源豐富，目前已發(fā)現(xiàn)經(jīng)濟魚類有30多種，厭氧繩菌和黃單胞菌等底泥細(xì)菌的大量存在為魚類改善環(huán)境條件，因此具有十分必要的存在。