一株野生側耳菌種鑒定及生物學特性

孫瑞澤 張耀玲 王勝寶 劉勇 陳進 黃重 魏玲 魏芳勤 荊丹 陳永剛 王艷龍 瞿艷麗 高紅玲 楊秀麗

摘? 要：以1株野生側耳屬菌株為試驗材料，采用ITS測序、同源序列比對、構建系統發育樹進行鑒別，通過單因素試驗確定影響其菌絲生長的因素。結果表明：該野生側耳屬菌株為哥倫比亞側耳（Pleurotus columbinus），其菌絲生長的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為牛肉膏，最適碳氮比為10∶1，最適pH值為6.0，最適培養溫度為25～30℃。

關鍵詞：哥倫比亞側耳;ITS測序;生物學特性

中圖分類號 S646.14? ?文獻標識碼 A? ?文章編號 1007-7731（2019）09-0034-4

Abstract：A wild Pleurotus strain was used as a test material. The wild strain was identified by ITS sequencing， homologous sequence alignment and phylogenetic tree construction. The biological characteristics were determined by single factor test.The results showed that the wild Pleurotus strain was identified as Pleurotus columbinus， the best carbon source was sucrose，the best nitrogen source was beef extract，the optimum carbon to nitrogen ratio was 10：1，the optimum pH value was 6.0， and the optimum culture temperature range was 25-30℃.

Key words：Pleurotus columbinus;ITS sequencing;Biological characteristics

側耳屬真菌營養價值較高，具有重要的經濟價值和藥用價值，是我國栽培面積較大的食用菌種類[1-2]。側耳屬的傳統分類及鑒定主要是基于子實體的宏觀形態和微觀結構特征的由于其子實體形態受到地域分布、子實體發生時間以及環境條件等因素的影響而出現不穩定性，且一些近緣物種的子實體形態非常相似，僅僅依靠外形很難分辨，因而傳統的分類方法已無法滿足一些未知種屬真菌的分類及鑒定要求[3-4]。隨著分子生物學的發展，許多學者利用分子生物學技術進行菌物系統發育和菌種輔助鑒定，其中以ITS序列分析技術應用最為廣泛。rDNA的ITS序列具有高度保守性，表現為種內相對一致，同時也有可以變化的區域，其有較為豐富的變異位點，這為種屬間的區分提供了可能[5]。本研究以采自秦巴山區的1株野生側耳菌株進行ITS測序及同源序列比對，通過構建系統發育樹鑒定該菌株為哥倫比亞側耳（Pleurotus columbinus）;同時，對其生物學特性開展了研究，旨在明確該菌株的最適碳源、氮源、碳氮比、pH值、溫度等生理指標，為其后續馴化栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試野生側耳菌株于2017年采自陜西省鎮巴縣小洋村，經組織分離獲得原種備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生側耳菌株的分子鑒定 采用DNA提取試劑盒提取DNA，利用通用引物ITS1、ITS4進行PCR擴增，將擴增后的PCR產物送上海生工進行ITS序列測序，測得序列登錄NCBI網站用Blast工具進行同源序列比對，從GenBank下載搜索到排名前6位同源序列的ITS序列，應用MEGA-X軟件進行系統發育分析，采用kimura2-parameter模式計算遺傳距離，采用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，Bootstrap參數設定為1000。

1.2.2 影響菌絲生長因素的確定

1.2.2.1 碳源 參照張國廣等[3]方法進行，以葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基（葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，維生素B110mg，瓊脂20g）中20g葡萄糖的含碳量為標準，分別用與20g葡萄糖相等含碳量的玉米粉、麥芽糖、果糖、淀粉、蔗糖代替葡萄糖進行碳源因子比較試驗，觀察不同碳源處理對菌絲生長的影響。

1.2.2.2 氮源 以葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基（葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，維生素B110mg，瓊脂20g）中5g蛋白胨的含氮量為標準，分別用與5g蛋白胨相等含氮量的硝酸銨、硫酸銨、谷氨酸、酵母浸粉、牛肉膏、硝酸鉀、尿素代替蛋白胨進行氮源因子比較試驗，觀察不同氮源處理對菌絲生長的影響。

1.2.2.3 碳氮比 在葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基中，改變蛋白胨添加量配成碳氮比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的培養基，觀察不同碳氮比處理對菌絲生長的影響。

1.2.2.4 溫度 在葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基中，分別設置15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等5個培養溫度，觀察不同溫度處理對菌絲生長的影響。

1.2.2.5 pH值 在葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基中，調節pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，觀察不同pH值處理對菌絲生長的影響。

1.3 項目測定 以上每個處理3次重復，接種后每日觀察菌絲生長情況，直至其中1個處理中菌絲長滿培養皿后停止觀察，測量菌絲生長長度，計算菌絲生長速率[3]。菌絲生長速率（mm/d）=菌絲生長長度/培養天數

1.4 數據分析 數據用平均值±方差的方式表述。對各處理菌絲平均生長速率進行方差分析，用新復極差法進行多重比較和顯著性分析（P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著）[3]。