miR-324-5p在結(jié)腸癌中低表達(dá)以及通過靶定ABL2抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲

洪永剛 鄭浩 劉啟志 郝立強(qiáng)△

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，上海 200433 ；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院，上海 200433)

結(jié)腸癌(colorectal cancer，CRC)又稱結(jié)直腸癌、直腸癌或腸癌，是2015年全球男性第三大常見癌癥，女性第二大常見癌癥[1]。miRNAs是一類非編碼小單鏈RNAs，其長度在18到25個(gè)核苷酸之間，它通過結(jié)合靶定mRNAs 3的非編碼區(qū)(UTR)的特定位點(diǎn)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNAs參與多種細(xì)胞和病理過程，包括調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡。miRNAs還參與腫瘤的形成和包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)展[3]。人們?cè)絹碓角宄恼J(rèn)識(shí)到，miRNA在多種癌癥中異常表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)，并可能在結(jié)腸癌的發(fā)生和進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[4-7]。本實(shí)驗(yàn)旨在尋找miR-324-5p在結(jié)腸癌中表達(dá)水平和探索下游靶基因，為結(jié)腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW620均由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫提供；16對(duì)結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織由海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外二科提供并經(jīng)過病理學(xué)鑒定；轉(zhuǎn)染試劑LipofactamineTM2000購買于美國Invitrogen公司；miR-324-5p mimic購買于上海吉瑪技術(shù)制藥有限公司。

1.2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116和SW620均在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并含有1%抗生素(鏈霉素和青霉素)。放置在含有5% CO2的37 ℃孵箱內(nèi)。

1．2．2 EGFP熒光報(bào)告載體實(shí)驗(yàn) 第一天將細(xì)胞種在24孔培養(yǎng)板中(5x10/孔)，待第二天細(xì)胞密度呈70%左右時(shí)，按照LipofactamineTM2000說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-324-5p mimic和含有ABL2 3’UTR的熒光報(bào)告載體以及對(duì)照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，用1xPBS清洗細(xì)胞，然后用RIPA裂解細(xì)胞，提取蛋白，最后用熒光光度儀(日立)進(jìn)行熒光值的測(cè)量，以EGFP轉(zhuǎn)染作為內(nèi)參。

1．2．3 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real timePCR)RNA的提取按照Trizol說明書進(jìn)行。對(duì)于miRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)，用特異的miR-324-5p的RT反應(yīng)，而對(duì)于cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，利用OligodT作為通用引物。對(duì)于Real-time PCR反應(yīng)體系，遵循以下流程：cDNA 1μL、Primers各 1 μL，SYBR 2熒光染料10 μL，無菌蒸餾水7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃變性5 min，然后是95 ℃，15 s、58 ℃ ，30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(試劑購自Takara公司，PCR儀器是Bio-Rad系統(tǒng))。

1．2．4 Western blot 第1天將細(xì)胞種在6孔培養(yǎng)板中(30×104/孔)，待第2天細(xì)胞密度呈70%左右時(shí)，按照LipofactamineTM2000說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，利用RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白，利用BCA蛋白測(cè)定法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，最后將30 μg蛋白進(jìn)行上樣，利用SDS-PAGE膠進(jìn)行western blot。ABL2的抗體(抗兔的多克隆抗體)購自美國Abcam公司，二抗是羊抗兔的單克隆抗體。GAPDH作為內(nèi)參。

1．2．5 體外遷移和侵襲試驗(yàn) 通過使用含有插入物的24孔板(8-μm孔；Costar，美國)對(duì)遷移進(jìn)行分析。同樣，通過使用涂有基質(zhì)的插入物(Costar，美國)進(jìn)行侵襲測(cè)定。下室充滿含有12 %血清的600 μL培養(yǎng)基，上腔裝有懸浮在200 μL無血清培養(yǎng)基中的2×104細(xì)胞。孵育24 h后，侵入到插入物底部的細(xì)胞被固定、染色、拍照，并通過在五個(gè)隨機(jī)視野中計(jì)數(shù)來定量。

2 結(jié) 果

2．1 Real time PCR檢測(cè)結(jié)腸癌組織和癌旁組織中miR-324-5p的表達(dá)結(jié)果 用RT-PCR方法研究人類結(jié)腸癌組織中miR-324-5p的水平結(jié)果顯示，與16例結(jié)腸癌癌旁組織相比，16例人類結(jié)腸癌組織中miR-324-5p表達(dá)水平顯著降低(圖1)。

圖1 十六對(duì)結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織 miR-324-5p 的表達(dá)

2．2 細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-324-5p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響 在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，細(xì)胞的侵襲和遷移發(fā)揮至關(guān)重要作用。為了評(píng)估m(xù)iR-324-5p是否是細(xì)胞侵襲和遷移的重要因素， HCT116和SW620細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-324-5p mimic后，用Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移侵襲能力。結(jié)果顯示，miR-324-5p mimic 組的細(xì)胞遷移侵襲能力較對(duì)照組明顯下降(圖2，A～D)。

2．3 ABL2是miR-324-5p的靶基因 通過Targetscan對(duì)miR-324-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示在ABL2的3’UTR上含有miR-324-5p的結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，我們的實(shí)驗(yàn)研究中構(gòu)建了含有ABL2與miR-324-5p結(jié)合位點(diǎn)序列及其結(jié)合位點(diǎn)突變序列的EGFP報(bào)告載體(圖4A)。結(jié)果表明，miR-324-5p模擬物的共轉(zhuǎn)染顯著降低了 HCT116和SW620細(xì)胞中含有野生型而非突變型ABL2的3’-UTR的熒光素酶質(zhì)粒的活性(P<0.001)(圖4B、4C).此外，qRT-PCR 和Western blot分析顯示，與模擬對(duì)照組相比，HCT116和SW620細(xì)胞中miR-324-5p模擬物的轉(zhuǎn)染在mRNA (P<0.01)和蛋白質(zhì)水平(P<0.05)上均顯著抑制了ABL2的表達(dá)(圖4D、4E)。

注：**P<0.01。

圖2 miR-324-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW620細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

圖3 Targetscan軟件預(yù)測(cè)ABL2為miR-324-5p靶基因

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

圖4 miR-324-5p直接靶定并且調(diào)控靶基因ABL2的表達(dá)

2.4 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ABL2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響 對(duì)結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行ABL2的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明ABL2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(圖5A)。HCT116和SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾ABL2的質(zhì)粒后，Transwell實(shí)驗(yàn)顯示結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯下降(P<0．001)(圖5B、5C)。

注：***P<0.001。

圖5 ABL2在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌遷移侵襲能力的影響

3 討 論

在本研究中，我們檢測(cè)了miR-324-5p在人類結(jié)腸癌中的表達(dá)量和分子機(jī)制。發(fā)現(xiàn)與相鄰的結(jié)腸癌癌旁組織相比，miR-324-5p在人類結(jié)腸癌組織中的表達(dá)被下調(diào)了。這些結(jié)果表明，miR-324-5p在人類結(jié)腸癌中的角色是腫瘤抑制因子。利用體外功能實(shí)驗(yàn)來評(píng)估m(xù)iR-324-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW620細(xì)胞中對(duì)侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。發(fā)現(xiàn)miR-324-5p mimic組的細(xì)胞遷移侵襲能力較對(duì)照組明顯下降，從而證實(shí)了miR-324-5p對(duì)結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移有抑制作用。

有研究顯示，ABL2是乳腺癌和前列腺癌的致癌基因[8-9]。然而，目前還沒有表明miR-324-5p和ABL2在調(diào)節(jié)人類結(jié)腸癌方面的作用的直接證據(jù)。在本研究中，我們?cè)噲D探討miR-324-5p對(duì)結(jié)腸癌中的ABL2的可能調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HCT116和SW620細(xì)胞中，上調(diào)miR-324-5p能直接下調(diào)ABL2的基因mRNA和蛋白質(zhì)水平。最重要的是siRNA介導(dǎo)的ABL2下調(diào)與miR-324-5p上調(diào)對(duì)于結(jié)腸癌的移徙具有相似的腫瘤抑制作用。因此，我們的研究表明，miR-324-5p和ABL2的反饋回路可能在調(diào)節(jié)人類結(jié)腸癌方面發(fā)揮重要作用。

目前對(duì)于結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，盡管提出了多種理論解釋，但是這種疾病的確切發(fā)生機(jī)制仍未完全闡明。所以尋找結(jié)腸癌新的診斷標(biāo)志物具有重要意義。本文結(jié)果表明，miR-324-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移轉(zhuǎn)移中起著重要作用，miR-324-5p 通過抑制ABL2 的作用而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移，這一結(jié)果為尋找結(jié)腸癌的致病因素提供了新的分子機(jī)制，并且為探索治療結(jié)腸癌新的分子標(biāo)記物提供了新的策略。