減量施氮對菘藍生長及藥材質量的影響

曹藝雯，屈仁軍，王 磊，申冰清，關佳莉，耿 麗，唐曉清*，王康才

（1 南京農業大學中藥研究所，江蘇南京 210095；2 句容市茅山仙草中藥材專業合作社，江蘇句容 212404）

氮作為植物生長發育的必需營養元素之一，對栽培作物的產量與品質的形成具有重要作用。施用氮肥既是當代農業生產發展的需要，也是作物獲得高產的重要措施[1]。我國耕地面積只占世界耕地總面積的7%左右，但是氮肥施用量卻超過了世界氮肥施用總量的25%，且仍在繼續增加[2]。氮肥的過度施用不僅導致作物產量陷入增長瓶頸，氮素利用率偏低[3]，而且使土壤出現大面積的質量退化，區域生態環境嚴重惡化[4]。因此減量施氮、提質增效成為我國糧食生產持續發展的重要途徑，也是中藥農業未來發展的需要[5]。尤其是作為中藥來源的藥用植物，栽培目標不能一味追求高產，更需要關注其藥用品質 (次生代謝產物含量)，在保證一定產量的前提下，降低氮肥的用量，以達到“藥用品質優良藥材”的目標，且在中藥農業未來必走生態農業之路的大背景下，降低氮肥使用量以改善日益惡化的土壤微環境勢在必行，開展減量施氮對藥用植物的品質影響研究也尤為必要。

菘藍 (Isatis indigoticaFort.) 為十字花科植物，其葉入藥為大青葉，具有瀉火、定驚、涼血消斑等功效；根入藥為板藍根，具有清熱解毒、涼血利咽等功效[6]。菘藍的主要活性成分為靛藍、靛玉紅與 (R,S)-告依春等生物堿類成分，這些成分受到不同氮素形態與氮水平的影響。適宜的氮肥水平有利于菘藍葉片的凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率的提高，顯著增加了菘藍的主根直徑和根長，有明顯的壯根效應[7-8]。減量施氮則對改善植物品質具有顯著影響，適度的脅迫環境促進了菘藍活性成分的積累，如靛藍、靛玉紅等生物堿類成分[9-11]。以本課題組先前對氮肥施用量的研究為基礎[7]，本研究通過田間小區試驗，探究減量施氮對菘藍生長及藥材質量的影響，旨在深入菘藍的栽培生理研究、優化菘藍栽培技術和提高其藥材質量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料培養

試驗地設在江蘇省句容市茅山仙草中藥材專業合作社基地，供試土壤基本理化性質為：pH 4.80，有機質含量10.0 g/kg，全氮0.802 g/kg，堿解氮92.1 mg/kg，有效磷8.20 mg/kg，速效鉀42.4 mg/kg。供試材料為來自于甘肅和山西兩個產地的菘藍，經南京農業大學王康才教授鑒定為十字花科植物菘藍(Isatis indigoticaFort.) 的角果 (生產上稱種子)。

1.2 試驗設計

試驗共設4個施氮水平，氮肥用量分別為0、169、338、675 kg/hm2(正常施氮量)，分別以CK、1/4N、1/2N、N表示，每處理設置3個重復小區，共有24個小區，小區規格為1.2 m × 4.0 m，為南北行向種植。各處理磷、鉀肥用量相同，均為180 kg/hm2。氮肥和磷鉀肥均分兩次追施，每次用量相同。采用隨機區組設計，進行常規田間管理。于2017年4月16日播種，第一次追肥在6月中旬，第二次追肥在9月上旬，在各行之間挖淺溝澆入，并及時覆土。氮肥選用尿素 (含氮46%)，磷、鉀肥選用KH2PO4(含P 26.7%，含K 16.4%)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生物量 菘藍生長8個月后采收，每小區隨機選取10株植株，洗凈后擦干，測量菘藍株高 (根莖頂端到最長葉片葉尖處)、主根長、主根直徑、葉鮮重、根鮮重，后置于105℃烘箱中殺青15 min，然后60℃烘干至恒重。測量葉干重、根干重，將葉和根干樣粉碎后分別過0.25 mm (60目) 和0.15 mm(100目) 篩，用于活性成分測定。折干率 = 干燥后株干重/株鮮重 × 100%。

1.3.2 可溶性糖與游離氨基酸含量 采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，采用酸性茚三酮比色法測定游離總氨基酸含量[12]。各處理3次重復。碳氮比(C/N) = 可溶性糖含量/游離氨基酸含量。

1.3.3 葉內總黃酮含量 總黃酮含量采用分光光度法測定。稱取0.1000 g菘藍葉干樣品，加入10 mL 70% (體積分數) 乙醇，置于超聲波中震蕩1 h后過濾，將濾液定容至25 mL，混勻。取2 mL濾液于試管內，加入0.5 mL 50 g/L NaNO2，搖勻后靜置6 min，再加入0.5 mL 100 g/L Al (NO3)3，搖勻后靜置6 min，然后加入4 mL 40 g/L NaOH，最后用70%乙醇定容至10 mL。搖勻后靜置15 min，于510 nm波長下比色，測定吸光值。

1.3.4 靛藍、靛玉紅含量 參照《中華人民共和國藥典》2015年版測定葉片中靛藍、靛玉紅含量[6]，略作修改。超高效液相色譜 (Ultra performance liquid chromatography, UPLC) 條件：分析柱為Aglient ZORBA x Eclidise Plus C18(2.1 mm × 50 mm，1.8 μm)；流動相為甲醇/水為72/28 (V/V)；流速0.30 mL/min；柱溫30°C；檢測波長289 nm；進樣體積2 μL。分別以靛藍，靛玉紅的色譜峰面積 (y) 與其對應的含量 (x，mg/L) 作標準曲線，計算回歸方程。靛藍標準曲線為y= 21.618x+ 8.857，R2= 0.9349 (n= 3)，線性范圍0～2 μg/mL；靛玉紅標準曲線為y=60.653x-7.4348，R2= 0.9980 (n= 3)，線性范圍0～10 μg/mL。

1.3.5 (R,S)-告依春含量 測定參照《中華人民共和國藥典》2015年版測定根中 (R,S)-告依春含量[6]，略作修改。高效液相色譜 (High performance liquid chromatography，HPLC) 條件：分析柱為Agilent ZORBA x SB-Aq C18(4.6 mm x 250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.02%磷酸溶液 (體積比20∶80)；流速0. 60 mL/min；柱溫30℃；檢測波長245 nm；進樣體積20 μL。以 (R,S)-告依春的色譜峰面積 (y) 與其相應的含量 (x，μg/mL) 作標準曲線，計算回歸方程。(R,S)-告依春標準曲線為y= 183729x-64369，R2= 0.9994 (n= 3)，線性范圍 0～40 μg/mL。

1.3.6 有效經濟產量 大青葉有效經濟產量 = 葉干重 × (靛藍含量+靛玉紅含量)；板藍根有效經濟產量 =根干重 × (R,S)-告依春含量。

1.4 數據處理

所測得數據的整理采用Microsoft Excel(Office 2010) 軟件，數據統計分析采用SPSS軟件 (20.0) 中的單因素方差分析法 (P＜ 0.05) 進行，處理間顯著性比較采用Duncan's新復極差法。

2 結果與分析

2.1 減量施氮對菘藍生長指標的影響

施氮量對藥用植物生物產地量積累有著顯著的影響(表1)。隨氮素水平提高，山西產地菘藍根鮮重與葉鮮重均呈增加的趨勢，在N處理下最大，且相較未施氮處理CK，N處理有效促進了其葉與根鮮重的增加，兩處理間差異顯著 (P＜ 0.01)；甘肅產地菘藍根鮮重與葉鮮重隨著氮素水平的提高表現出先增加后減少的趨勢，在1/2N處理下達到最大值。干重變化趨勢與鮮重相同，均隨施氮量升高而增加，甘肅產地菘藍的葉、根與單株干重在1/2N處理下最大。綜合分析，在適宜的施氮量范圍內有利于菘藍生物量的提高，甘肅產地菘藍對施氮量的響應比山西產地菘藍更為敏感，表現出一定的低氮耐受力。不同施氮量處理后，菘藍單株折干率差異不顯著(P＞ 0.05)。

如表2所示，隨著施氮量的增加，山西與甘肅產地菘藍根長均表現出增加趨勢，在N處理下最大，且顯著高于CK、1/4N、1/2N處理。株高的變化趨勢與根長相同，其中，山西產地菘藍在N處理下株高最大，且顯著高于其他處理，1/4N、1/2N處理間差異不顯著，但均顯著高于CK處理。甘肅產地菘藍株高在N處理下最大，1/2N處理下株高也維持在較高水平，兩處理間差異不顯著，但顯著高于CK處理。主根直徑變化趨勢與根長、株高的趨勢相似，不同施氮量處理后，山西與甘肅產地菘藍植株主根直徑差異均達到顯著水平，兩個產地菘藍在N處理下的主根直徑比CK處理分別高出約131%、114%。說明施氮量與菘藍植株的生長指標呈正相關，氮素對菘藍的生長發揮著重要的作用。

表 1 不同施氮水平下菘藍生物量 (n = 10)Table 1 Biomass of I. indigotica under different nitrogen application rates

表 2 不同施氮下菘藍植株生長狀況 (n = 10)Table 2 Growth of I. indigotica under different nitrogen application rates

2.2 減量施氮對菘藍葉中可溶性糖和游離氨基酸含量的影響

表3結果顯示，山西、甘肅產地菘藍在CK處理下可溶性糖含量均維持在較高水平，在N處理下含量較低，其中山西產地菘藍在CK處理下可溶性糖含量顯著高于其他處理 (P＜ 0.05)，甘肅產地菘藍在N處理下可溶性糖含量顯著低于其它處理，說明氮脅迫處理促進了菘藍可溶性糖的合成與積累。山西、甘肅兩個產地菘藍均以N處理下游離氨基酸的含量最高 (表3)，且甘肅產地菘藍的N處理與同組其他處理間差異顯著 (P＜ 0.05)，這可能與氮素促進游離氨基酸的合成有關。兩個產地菘藍均以CK處理下游離氨基酸的含量顯著低于其他處理。相對于N處理，山西、甘肅產地菘藍的在CK處理游離氨基酸的含量分別降低了47.7%，43.1%，這可能與低氮水平下氮代謝能力較弱有關。

碳氮比可以反映植物的抗逆水平。表5表明，山西產地碳氮比表現出隨氮素脅迫程度降低而下降的趨勢，在CK處理下碳氮比最高，且顯著高于其余三個處理。甘肅產地菘藍碳氮比表現出隨脅迫程度降低而先升高后下降的趨勢，這可能與甘肅產地菘藍在CK處理下菘藍代謝調節機構被一定程度的破壞有關，但氮素脅迫條件下菘藍碳氮比均顯著高于正常氮處理。

2.3 減量施氮對菘藍葉中靛藍、靛玉紅及總黃酮含量的影響

施氮量對菘藍葉內靛藍的含量有著顯著的影響(表4)，其中山西產地菘藍在N處理下靛藍含量最低，且顯著低于其它處理 (P＜ 0.05)；相較N處理，CK、1/4N、1/2N處理靛藍含量分別高出約8.13倍、3.00倍、1.40倍。甘肅產地菘藍葉內靛藍含量在CK處理下最高，且顯著高于其他處理，其余3個處理間差異不顯著 (P＞ 0.05)。綜合分析，靛藍含量隨施氮量增加而逐漸降低，以N處理下靛藍含量較低。菘藍葉內靛玉紅含量變化也與施氮量有著顯著的關系，如表4所示，CK處理下山西產地的靛玉紅含量最高，隨施氮量的提高表現為遞減的趨勢，且4個處理間差異顯著 (P＜ 0.05)。不同施氮處理下，甘肅產地的CK、1/4N、1/2N處理下靛玉紅的含量均維持在較高水平，3個處理間差異不顯著 (P＞0.05)，但顯著高于N處理 (P＜0.05)。這說明減量施氮可能會刺激菘藍的次生代謝，促進靛藍、靛玉紅等次生代謝產物的形成。

表 3 不同施氮下菘藍葉中營養物質含量 (n = 3)Table 3 Nutrient contents of Isatis indigotica leaves under different nitrogen application rates

表 4 不同施氮下菘藍葉中靛藍、靛玉紅及總黃酮含量 (n = 3)Table 4 Indigo, indirubin and total flavonoid contents of I. indigotica leaves under different nitrogen application rates

施氮量對總黃酮的含量影響顯著，山西、甘肅兩個產地菘藍均以CK處理下總黃酮含量最高，隨著施氮量的提高，總黃酮的含量呈現一定的下降趨勢。這說明減量施氮促進了黃酮類次生代謝產物的合成。山西產地菘藍在N處理下總黃酮含量最低，且顯著低于其他處理，在CK、1/4N、1/2N處理間差異不顯著 (P＞ 0.05)；甘肅產地菘藍則在CK、1/4N處理間差異不顯著，均維持在較高的水平，1/2N、N處理下顯著下降。

2.4 減量施氮對菘藍根中 (R, S)-告依春含量的影響

減量施氮下兩個產地菘藍根中 (R,S)-告依春含量的變化與靛藍和靛玉紅變化趨勢類似，表現為在CK處理下 (R,S)-告依春含量最高，隨著施氮量的提高逐漸下降(圖1)。其中，山西產地菘藍在1/4N處理下 (R,S)-告依春含量也維持在較高水平，CK、1/4N處理與1/2N、N處理間差異顯著 (P＜ 0.05)，這說明減量施氮可能刺激了菘藍的次生代謝過程，促進了 (R,S)-告依春的合成。甘肅產地菘藍的根中 (R,S)-告依春的含量在各處理間均差異顯著 (P＜ 0.05)，且相較CK處理，1/2N和N處理后 (R,S)-告依春含量分別下降了87.1%、71.5%，說明甘肅產地菘藍可能對施氮量的變化更為敏感。

圖 1 不同施氮下菘藍根中 (R, S)-告依春含量 (n = 3)Fig. 1 Contents of (R, S)-epigoitrin in roots of I. indigotica under different nitrogen application rates

2.5 減量施氮對大青葉和板藍根有效經濟產量的影響

表5結果顯示，在1/4、1/2處理下，山西產地大青葉的有效經濟產量均維持在較高的水平，以N處理下最低，且相較1/4N低約63.2%，兩處理間差異顯著；甘肅產地在1/2處理下大青葉有效經濟產量取得最大值，1/4處理下也維持在較高水平，兩處理間差異不顯著，但顯著高于CK處理，相較CK處理，1/4N處理分別高出約72.7%、74.2%、16.3%。

減量施氮對板藍根產量也有顯著影響，山西產地表現為隨施氮水平的增加，板藍根有效經濟產量呈增加的趨勢，在N處理下取得最大值，且與其他處理下間差異顯著，相較CK處理高出約7.7倍；甘肅產地則表現為先增加后減小再增加的趨勢，在1/4N處理下取得最大值，相較N處理高出約2.0倍，四個處理間差異顯著。

表 5 不同施氮下大青葉和板藍根有效經濟產量 (n = 3)Table 5 Effective economic yields of Isatidis Folium and Isatidis Radix under different nitrogen application rates

3 討論

3.1 減量施氮對菘藍生長的影響

氮素是植物生長所需的重要基本元素之一，對植物最終產量的貢獻率約為40%～50%，因此氮素水平的高低與植物的生長密切相關。適宜的氮水平有利于植物生物量積累，提高植物的抗逆性，氮素水平過高則不利于植物生長[13]。本研究中，山西菘藍單株生物量隨著施氮量提高而增加，施用氮肥明顯提高了其植株的鮮重、干重、株高、主根直徑等指標，這與王雨等[8]在不同施氮水平對鹽脅迫下的研究結果一致，這說明氮素通過氮代謝參與了植株形態的建成，適宜的施氮水平促進了含氮化合物的積累，亦或是通過直接或間接的影響了植株的光合作用，從而進而影響植株生物量的積累。甘肅菘藍單株生物量則隨著施氮量的升高表現出先增加后減少的趨勢，與生長性狀的變化趨勢并不完全一致，推測可能是甘肅菘藍對氮水平較為敏感，N處理視為高氮投入，一方面，生長前期氮肥過多，使植物過度生長，不進行生理分化；后期高氮進一步降低了植物抗氧化酶活性，加重了菘藍膜脂過氧化程度，促進植物衰老而影響了其生物量的形成，這與湯利等[14]和高茂盛等[15]的研究結果一致；另一方面，可能因供試土壤為酸性土壤，酸性土壤下高氮條件對其產量降低有更為顯著的影響[16]。

折干率是衡量藥材品質和產量的重要指標，對實際生產具有重要意義，折干率的大小受自身遺傳因素以及外界環境因素影響[17]。山西、甘肅兩個產地菘藍植株在不同氮水平下折干率差異不顯著，即氮營養對菘藍折干率影響不明顯。

3.2 減量施氮對菘藍營養物質合成的影響

可溶性糖作為碳同化過程的主要產物之一，在植物逆境生理的調控中發揮著重要作用，其含量的升高通常與植物抗逆性的提高有關[18]。研究發現，不同供氮水平下，CK處理下葉片中可溶性糖含量較高，且隨著施氮量增高，可溶性糖含量呈遞減趨勢，這與孫興祥等[19]在不同氮素水平對菠菜生長和品質研究結果一致，這可能與低氮條件下，植物通過可溶性糖含量增加，提高了植物葉片的滲透調節能力，從而延緩葉片衰老，為植物生長提供充足的碳源有關。游離氨基酸作為主要含氮化合物與施氮量密切相關，兩個產地菘藍在N處理下的游離氨基酸含量均明顯高于CK、1/4N、1/2N處理，這說明了氮對氨基酸的合成有一定的促進作用，游離氨基酸的含量與施氮量呈正相關。同一施氮水平下，不同產地菘藍游離氨基酸的含量差異不顯著。

有研究指出，游離氨基酸作為氮代謝中心物質，是反映植物氮代謝情況的有效指標，可溶性糖為碳代謝的中間產物，是反映植物碳代謝強弱的有效指標，可溶性糖與游離氨基酸的比值大致可以反映C/N比，植物碳氮平衡 (C/N) 又反映了植物在逆境下的適應能力[20]。曹蓓蓓[21]通過研究不同品種和施氮條件對小麥葉片衰老與碳氮平衡的影響發現，隨施氮量的下降，小麥的碳氮比顯著升高，植物抗逆性增強，但同時葉綠素含量降低，葉片衰老。本研究中，兩個產地菘藍碳氮比隨著氮素水平的降低而提高，這與曹蓓蓓研究結果一致。適度低施氮水平下，甘肅產地菘藍的碳氮比高于山西產地，這可能說明甘肅產地菘藍品種對低氮的耐受性強于山西產地。

3.3 減量施氮對菘藍次生代謝產物積累的影響

靛藍、靛玉紅均屬于含氮化合物，其含量的積累與氮素水平密切相關。山西、甘肅產地菘藍葉內的靛藍、靛玉紅含量均以CK處理下最高，且隨著供氮水平提高呈下降趨勢，這可能是由于在遭受逆境脅迫 (低氮脅迫) 時，其體內次生代謝產物的合成與積累增加有關。(R,S)-告依春不僅是板藍根的主要活性成分，同時也可提高植物的抗氧化能力以應對外界的不良環境。在CK、1/4N氮處理下山西和甘肅的 (R, S)-告依春含量均保持在較高水平，且顯著高于1/2N、N處理，這與靛藍、靛玉紅的變化結果相一致。相對于CK，甘肅的 (R,S)-告依春在1/2N、N處理下表現為明顯的下降，一方面可能是甘肅菘藍在低氮脅迫下抗逆基因表達更強有關，另一方面可能與酸性土壤對高氮條件下板藍根中 (R,S)-告依春含量合成有顯著抑制作用有關。

黃酮類物質作為植物次生代謝產物之一，具有抵御不良環境的作用。兩個產地菘藍在CK處理下總黃酮的含量顯著高于其他處理，且隨施氮量的升高總黃酮含量下降，這與劉偉的研究結果相一致[22]。這可能與低氮脅迫環境下，植物通過增強自身一系列次生代謝過程以應對環境的變化有關。

3.4 減量施氮對菘藍有效經濟產量的影響

目前關于氮素營養對菘藍影響的研究主要集中在其活性成分含量上，而有效經濟產量指標則可綜合反映藥材的產量和品質，為其合理栽培提供切實理論依據。本研究中，氮素水平對大青葉和板藍根的有效經濟產量有顯著的影響，減量施氮處理下(1/4N、1/2N)，山西、甘肅產地大青葉的有效經濟含量均處于較高水平，主要原因可能是施氮量的減少雖然影響植物正常生長，但同時也促進其次生代謝產物的合成[23]，這些次生代謝產物即是菘藍的藥效成分。山西產地板藍根的有效經濟產量隨施氮水平的提高而增加，相較N處理，減量施氮處理下 (1/4N、1/2N) 該指標約低37.2%，推測是因為在不同處理對(R,S)-告依春含量的影響不顯著，而顯著促進其生長量所致；甘肅產地板藍根的有效經濟產量以1/4N處理下取得最大值，在1/2處理下則突然下降，推測與 (R,S)-告依春含量的突然下降有關，具體原因有待進一步的研究。綜合考慮，適當減少氮營養 (1/4N、1/2N)，有利于山西、甘肅產地菘藍總有效經濟產量的提高。

4 結論

氮素水平的提高可顯著增加菘藍的鮮重、干重等生物量，對菘藍一些次生代謝產物的積累則不利。減量施氮，菘藍的可溶性糖、碳氮比、總黃酮含量，靛藍、靛玉紅、(R,S)-告依春等次生代謝產物含量均顯著提高。兩個產地菘藍表現出對氮素水平不同的響應規律，甘肅產地菘藍對低氮水平更為敏感，可能具有一定的耐低氮潛力。綜合考慮大青葉和板藍根的有效經濟產量指標，在菘藍大田實際生產中，可適當采用減量施氮處理，建議將氮肥施用量控制在169～338 kg/hm2。