便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀的研發(fā)和應(yīng)用

韋仲，毛華，黃富榮，方濤

1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣東 廣州 510282；2.暨南大學(xué) 光電工程系，廣東 廣州 510632

引言

拉曼光譜是一種散射光譜，可以對(duì)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行定性和定量分析，其檢測(cè)過(guò)程不需要對(duì)樣品進(jìn)行特殊預(yù)處理，也不會(huì)對(duì)樣品造成損傷，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、精確度高、客觀性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)診斷中具有較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[1-2]。拉曼光譜用于胃癌的診斷研究已經(jīng)有十余年，研究對(duì)象包括離體胃癌細(xì)胞[3]、胃癌組織[4]、胃癌動(dòng)物模型[5]、胃癌患者的血清[6]等，研究手段包括傅里葉變換拉曼光譜[7]、表面增強(qiáng)拉曼光譜[8]和光纖拉曼光譜[9]等。上述研究的結(jié)果均從不同角度證實(shí)了拉曼光譜能夠鑒別胃癌，為拉曼光譜技術(shù)向臨床應(yīng)用推廣奠定了基礎(chǔ)。

既往的研究為了獲取精確的光譜數(shù)據(jù)，所使用的拉曼光譜儀均為激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，具有檢測(cè)精度高、定位準(zhǔn)確、外界聲噪小的特點(diǎn)，該類設(shè)備體積大、質(zhì)量重，不能隨意移動(dòng)，價(jià)格昂貴，需要定時(shí)由專人進(jìn)行日常維護(hù)，需要在暗室環(huán)境下進(jìn)行檢測(cè)，在臨床診斷方面的實(shí)用性大打折扣。便攜式拉曼光譜儀具有體積小、質(zhì)量輕、便于攜帶、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，隨著技術(shù)的發(fā)展，便攜式拉曼光譜儀的檢測(cè)性能，如分辨率、靈敏度、穩(wěn)定性、抗干擾能力等方面，有了極大的提高，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于制藥在線監(jiān)測(cè)[10]、爆炸物監(jiān)測(cè)[11]、機(jī)場(chǎng)安檢[12]、食品安全[13]、考古[14]、農(nóng)業(yè)[15-16]、生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)[17]等方面的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。但是便攜式拉曼光譜儀在臨床診斷方面的應(yīng)用研究并不多見(jiàn)，在胃癌的診斷應(yīng)用更少，因此本文介紹了一種便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀，初步探討該設(shè)備對(duì)胃癌檢測(cè)的可行性，為更進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)基于內(nèi)窺鏡的光纖拉曼光譜系統(tǒng)提供理論參考。

1 便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀的研發(fā)

1.1 工作原理

由激光器發(fā)出一束激光，經(jīng)輸出光纖傳導(dǎo)，由光學(xué)系統(tǒng)聚焦照射在待測(cè)樣品上，產(chǎn)生拉曼效應(yīng)。拉曼檢測(cè)儀的探頭對(duì)樣品產(chǎn)生的拉曼散射光進(jìn)行收集，經(jīng)由輸入光纖傳輸給拉曼光譜儀，轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的電信號(hào)，傳遞至計(jì)算機(jī)進(jìn)行信號(hào)處理，最終得到拉曼光譜圖像。便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀的原理示意圖，見(jiàn)圖1。

圖1 便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀的原理示意圖

1.2 系統(tǒng)組成

1.2.1 激發(fā)光光源

激光具有定向發(fā)光、方向性好、亮度極高、顏色極純、相干性高等優(yōu)點(diǎn)，因此激光是作為激發(fā)光源的最優(yōu)選擇。常用的激光器有的 514.5 nm Ar離子激光器、632.8 nm 的He-Ne激光器、532 nm或者785 nm的半導(dǎo)體激光器。根據(jù)既往的研究[18]可知，在應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織時(shí)，多選用近紅外波段（780～2526 nm）的激光。在這個(gè)波段區(qū)間內(nèi)，腫瘤組織的成分中電子從基態(tài)躍遷較少，產(chǎn)生的自體熒光現(xiàn)象較弱，因而熒光干擾也較低，而且相對(duì)能量較弱的光子不易使腫瘤組織吸收熱量過(guò)多而產(chǎn)熱分解。根據(jù)研究需求，本設(shè)計(jì)定制了785 nm半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)光源。

1.2.2 光纖探頭

便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀的光纖探頭的主要功能有兩個(gè)，一是輸出激光，使待測(cè)樣品產(chǎn)生拉曼效應(yīng)，激發(fā)拉曼光信號(hào)；二是輸入光纖，接收樣品所產(chǎn)生的拉曼信號(hào)，濾除包括入射激光在內(nèi)的非拉曼信號(hào)，并將拉曼信號(hào)導(dǎo)出至光譜儀中。

目前拉曼光纖探頭主要有雙光纖探頭和多光纖探頭[19]。雙光纖探頭中的兩根光纖，一根用于激發(fā)樣品，一根用于收集拉曼信號(hào)，但是由于光纖本身的背景噪聲較大，不利于提高便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀的有效率和準(zhǔn)確率，通過(guò)理論分析和蒙特卡羅模擬法（Monte Carlo Simulation，MCS），選用多光纖探頭，建立了適用于便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀的深度分辨拉曼光纖探頭。

1.2.2.1 光纖種類的選擇

查閱文獻(xiàn)可知[20]，在785～1200 nm激發(fā)光波長(zhǎng)范圍內(nèi)，低羥基濃度的光纖在傳遞拉曼信號(hào)過(guò)程中，信號(hào)衰減更小，同時(shí)也可以減少光纖的拉曼散射和熒光效應(yīng)，因而選擇低羥基濃度的光纖。

1.2.2.2 光纖的參數(shù)選擇

光導(dǎo)纖維是一種透明的玻璃纖維絲，直徑只有1～100 μm左右。它是由內(nèi)芯和外套兩層組成，內(nèi)芯的折射率a大于外套的折射率b，光由一端進(jìn)入，在內(nèi)芯和外套的界面上經(jīng)多次全反射，從另一端射出。光纖的主要參數(shù)為數(shù)值孔徑（Numerical Aperture，NA）表征了光纖收集光信號(hào)的能力，定義為：

目前公認(rèn)，當(dāng)NA為0.18～0.23時(shí)，光纖探頭的采集效率和組織探測(cè)深度達(dá)到最理想的水平[21-22]。通過(guò)對(duì)不同NA值的光纖進(jìn)行傳導(dǎo)效率測(cè)定（圖2），便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀選擇NA值為0.22的光纖。

圖2 NA值對(duì)傳光效率的影響

1.2.2.3 光纖數(shù)量選擇

以發(fā)射和收集相分離的設(shè)計(jì)，內(nèi)部包含多根收集光纖環(huán)繞1根激發(fā)光纖，既能夠減小發(fā)射光纖中產(chǎn)生的背景信號(hào)的干擾，又能增大探頭直徑，提高收集效率。通過(guò)MCS分析可得，采用六邊形結(jié)構(gòu)的光纖排列能夠使得光纖探頭的設(shè)計(jì)更加靈活，信號(hào)作用的有效范圍最大化，結(jié)構(gòu)如圖3所示。光纖數(shù)目滿足公式：

圖3 光纖排列結(jié)構(gòu)示意圖

1.2.2.4 光纖末端角度選擇

最早由Wilson等[23]在1999年提出，將光纖末端切成一定的角度，可以增加拉曼信號(hào)的收集效率。Wang等[24]探索研制在體內(nèi)窺鏡的報(bào)道中也指出，搭配斜面的光纖可以明顯接收拉曼信號(hào)的效率，利用MCS發(fā)現(xiàn)當(dāng)NA=0.22時(shí)，搭配斜面光纖的接收效率至少是平面光纖的1.8～4倍。光纖斜面角度（B）對(duì)收集效率的模擬，見(jiàn)圖4。

圖4 光纖斜面角度對(duì)收集效率的模擬

1.2.2.5 光纖封裝方式

激發(fā)光纖和收集光纖需同時(shí)封裝于探頭的一端，需保證既能減少外界聲噪的干擾，又可以盡量減少拉曼信號(hào)的丟失。對(duì)于激發(fā)光纖，一端采用FC接口封裝，與激光器輸出接口對(duì)應(yīng)，另一端采用直徑為4 mm的金屬套筒封裝，并將光纖出口置于套筒端面中心；對(duì)于收集光纖，一段采用“外螺紋＋孔”“內(nèi)螺紋＋針”即Small A Type（SMA）接口封裝，具有高力學(xué)強(qiáng)度、高耐久性、高可靠性及低回波損耗等顯著特點(diǎn)，匹配相應(yīng)接口的拉曼光譜儀，另一端采用同樣的封裝。激發(fā)光纖和手機(jī)光纖封裝接口，見(jiàn)圖5。

圖5 激發(fā)光纖FC接口和收集光纖SMA接口

1.2.2.6 物鏡的設(shè)計(jì)

為了保證入射激光能夠準(zhǔn)確地照射在待測(cè)樣品上，通常會(huì)在激發(fā)光纖前加裝光纖準(zhǔn)直器，球面透鏡是最常用的裝置，在物鏡加上一球面透鏡可以起到聚焦光纖的作用，能夠在一定程度上提高探頭的采集效率。物鏡的直徑可根據(jù)球面透鏡的直徑來(lái)確定，所設(shè)計(jì)的物鏡直徑15 mm，入射光經(jīng)過(guò)透鏡后所形成的入射光斑點(diǎn)有效照射直徑為1 mm。物鏡側(cè)面示意圖，見(jiàn)圖6。

圖6 物鏡側(cè)面示意圖

1.2.3 微型光譜儀

微型光譜儀是便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀的核心部件，其性能直接影響到系統(tǒng)的檢測(cè)范圍和光譜分辨能力，通常來(lái)說(shuō)，光譜儀的光譜范圍越大，相應(yīng)的光譜分辨力就會(huì)越低。目前便攜式拉曼光譜儀所采用的光譜儀光學(xué)結(jié)構(gòu)主要有四種，經(jīng)典的車尼爾-特爾納（C-T）結(jié)構(gòu)，體全息透射光柵結(jié)構(gòu)，全息凹面平場(chǎng)光柵結(jié)構(gòu)，中階梯光柵結(jié)構(gòu)。本設(shè)計(jì)選用由荷蘭（北京）愛(ài)萬(wàn)提斯科技有限公司生產(chǎn)的AvaSpec-ULS2048LTEC光譜儀，具有高穩(wěn)定性、高靈敏度、高采樣速度、低噪聲、大動(dòng)態(tài)范圍的特點(diǎn)。

利用785 nm半導(dǎo)體激光器、傳導(dǎo)光纖、光纖探頭、微型光譜儀、載物臺(tái)及安裝光譜分析軟件的計(jì)算機(jī)構(gòu)建便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀，系統(tǒng)全貌如圖7所示，主要參數(shù)如表1所示。

圖7 便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀

表1 便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀主要參數(shù)

2 胃組織標(biāo)本檢測(cè)

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)中使用的設(shè)備是便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀和激光共聚焦顯微拉曼光譜儀。激光共聚焦顯微拉曼光譜儀由英國(guó)RENISHAW公司生產(chǎn)，基本參數(shù)設(shè)置為激發(fā)光波長(zhǎng)785 nm，分辨率 1～2 cm-1，最大激發(fā)光功率約 300 mw，最大波譜范圍 100～3200 cm-1。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

收集行電子胃鏡檢查并經(jīng)病理證實(shí)的正常胃粘膜組織和胃癌組織各10例，分別用便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀和激光共聚焦顯微拉曼光譜儀進(jìn)行光譜采集。

2.2.1 便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀

在普通實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，將待測(cè)樣本置于載玻片表面，光纖探頭以支架固定，探測(cè)端與待測(cè)標(biāo)本緊密接觸，以模擬臨床原位檢測(cè)。調(diào)整激光照射至待測(cè)樣本，經(jīng)3次掃描累加，完成1次掃描，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次取平均值，重復(fù)采集以保證實(shí)現(xiàn)光譜的可重現(xiàn)性。

2.2.2 激光共聚焦顯微拉曼光譜儀

在暗室中，將載玻片置于載物臺(tái)，用10倍目鏡觀察組織樣品，調(diào)整物鏡方位，使激光焦點(diǎn)聚集到組織樣品上，按預(yù)設(shè)參數(shù)獲得樣品組織的拉曼光譜經(jīng)3次掃描累加，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次取平均值，重復(fù)采集以保證實(shí)現(xiàn)光譜的可重現(xiàn)性。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

原始光譜信號(hào)包括自體熒光信號(hào)、噪音和拉曼信號(hào)，利用Raman-Wire3.2軟件和一種基于R語(yǔ)言的背景去噪程序，只留下組織的拉曼光譜信號(hào)。使用Matlab及Origin Pro8軟件在計(jì)算機(jī)上對(duì)所得光譜圖進(jìn)行處理比較。圖8和圖9顯示為兩種設(shè)備獲取的正常胃粘膜組織和胃癌組織平均拉曼光譜，從圖中可以看到，胃粘膜組織的主要拉曼光譜 波 峰 位 于 829、853、964、1003、1032、1154、1316、1450、1659 cm-1。其歸屬主要來(lái)源于蛋白質(zhì)和脂類，與已知的結(jié)果是一致的。便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀所獲取的光譜結(jié)果雖然在強(qiáng)度上略有差異，但其所表現(xiàn)的光譜具有較好的完整性。

圖8 正常組織的拉曼光譜

圖9 胃癌組織的拉曼光譜

3 討論及總結(jié)

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)有較高的發(fā)病率和死亡率，及早診斷對(duì)胃癌預(yù)后意義重大[25]。大量的基礎(chǔ)研究已經(jīng)證明，拉曼光譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)無(wú)損、快速、客觀地鑒別出胃癌組織和正常組織，將這一技術(shù)與臨床結(jié)合，為胃癌的診斷提供了新的技術(shù)和思路。本文闡述了一種便攜式光纖拉曼胃癌檢測(cè)儀，785 nm半導(dǎo)體激光器能合理激發(fā)樣本組織產(chǎn)生拉曼效應(yīng)，獨(dú)立設(shè)計(jì)研制的光纖探頭能夠?qū)崿F(xiàn)良好的傳導(dǎo)和收光，微型光譜儀能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)光電轉(zhuǎn)換，輸出可視化光譜。利用該系統(tǒng)在普通環(huán)境中對(duì)正常胃粘膜組織和胃癌組織進(jìn)行檢測(cè)，獲得的光譜與共聚焦顯微拉曼光譜儀所測(cè)同類樣品的光譜具有較高的一致性，說(shuō)明該系統(tǒng)具有較好的檢測(cè)能力，更重要的是便攜系統(tǒng)本身具有體積小、質(zhì)量輕、便于攜帶及維護(hù)、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，為實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用提供了可能。下一步，將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)研究，繼續(xù)將設(shè)備微型化，設(shè)計(jì)研發(fā)一種可以通過(guò)胃鏡檢測(cè)孔的檢測(cè)設(shè)備，實(shí)現(xiàn)在常規(guī)胃鏡檢查的同時(shí)，對(duì)胃黏膜進(jìn)行拉曼檢測(cè)以鑒別正常組織和癌變組織，為臨床診斷提供依據(jù)。