微生物對儲藏稻谷結塊及品質影響的研究

何 榮 章 鋮 陳尚兵 汪 靜 鄒昱成 邢常瑞 袁 建 鞠興榮

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心；江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

我國經濟進入新常態時期，實施科技興糧工程、促進糧食科技創新發展是貫徹國家糧食安全新戰略的根本要求[1]。“十三五”規劃提出：“堅持最嚴格的耕地保護制度，堅守耕地紅線，實施藏糧于地、藏糧于技戰略，提高糧食產能，確保谷物基本自給、口糧絕對安全[2]。”國家對糧食安全問題是高度重視，因此糧食科技工作需要緊緊圍繞國家糧食安全戰略，聚焦糧食安全，重點攻克綠色生態儲糧、糧食節約減損、質量衛生安全等重大科技難題[3]。

糧食作為生命體，收獲后到儲藏環節與環境形成了儲糧生態系統，儲糧生態系統包括溫度、濕度、微氣流等非生物因素和微生物、蟲害等生物因素，這些均是影響儲糧生態系統穩定的重要因素[4]。而糧食結塊是糧食儲藏過程中存在的一個重大安全問題，糧食結塊不僅會降低糧食品質，還會對糧食出倉造成困難，經常造成漏斗堵塞，在清理糧食結塊的過程偶有人員傷害等事故發生[5]。結露會使糧堆局部水分含量升高，易引起糧食呼吸旺盛，微生物活動加劇，若處置不當則最終會引起糧堆結塊[6]。實際生產中加強對糧食儲藏環境的管理，如合理通風以及在鋼板筒倉外層采取保溫等措施，可以有效避免糧食結塊的發生[7]。微生物活動是導致糧食結塊的主要成因，微生物為了生存就必須從環境中分解和吸收營養物質，用以合成自身的細胞物質并獲得代謝所需要的能量，而糧食就是微生物天然的營養庫[8]；并且糧食中微生物的活動時刻影響著糧食的品質，甚至降低糧食的營養成分，影響糧食的食用價值和加工質量[9]。

微生物活動易導致稻谷結塊，而對于糧食結塊起最大“貢獻”的微生物卻鮮有研究；此外，以及稻谷結塊品質變化與成因之間的關系尚不明確，其中蘊含許多科學問題亟待解決。相比細菌而言，霉菌更易引起糧堆結塊[10]，本實驗選用黑曲霉、白曲霉、黃曲霉、產黃青霉、灰綠曲霉這5種常見的霉菌對稻谷進行污染的接種處理，最終引起稻谷結塊，通過測定結塊稻谷的質量指標，分析稻谷品質變化與稻谷結塊成因之間的關系，以期為我國糧食安全儲藏提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2017年南京秋收新糧(粳稻)；直鏈淀粉標準溶液、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉(所涉及的化學試劑均為優級純)；α-淀粉酶活性檢測試劑盒、過氧化物酶測試盒、脂肪酶(LPS)活性檢測試劑盒；黑曲霉、白曲霉、黃曲霉、灰綠曲霉、產黃青霉：均來源于實驗室對儲糧霉菌的分離純化。

PQX-300D多段可編程人工氣候箱、Perten RVA4500型快速黏度分析儀、BLH-3250型實驗礱谷機、JNMJ6型檢驗碾米機、D/max 2500 PC型X射線衍射儀、TM3000型掃描電子顯微鏡、Spectramax M2e型多功能酶標儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物培養與接種

將黑曲霉、白曲霉、黃曲霉、產黃青霉、灰綠曲霉五種有害霉菌分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)，置于28 ℃、85% RH恒溫培養箱中，待霉菌生長14 d后產生大量的孢子，用無菌水(121 ℃、20 min)沖洗培養基表面，制作成霉菌的孢子懸浮液，采用平板計數法分別測定5種霉菌孢子懸浮液的孢子濃度，并將其濃度調整至105～106CFU/mL。之后將5種霉菌孢子懸浮液，置于4 ℃冰箱儲存備用。

將稻谷樣品(熱風滅菌處理)分為若干份，每份質量50 g，分裝于直徑為150 mm的培養皿。并隨機抽取裝有稻谷樣品的培養皿若干，作為空白對照組，其余為實驗組。實驗組的每份稻谷樣品表面接種1 mL菌液，由于所接種的霉菌類別不同，將接種黑曲霉、白曲霉、黃曲霉、產黃青霉、灰綠曲霉的實驗組依次命名為實驗組1～5，此外實驗組設平行對照若干。對照組的每份稻谷樣品加入1 mL無菌水，充分混勻后將培養皿放置于的人工氣候箱中儲藏(28 ℃、60% RH)。樣品從接種霉菌起，每7 d，隨機選取實驗組1～5與對照組中的稻谷樣品各1份進行菌落總數的測定。

1.2.2 霉菌孢子懸浮液孢子數測定

參照LS/T 6132—2018《糧油檢驗 儲糧真菌的檢測》孢子計數法進行測定[11]。

1.2.3 霉菌菌落總數測定

參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗》霉菌和酵母計數進行測定[12]。

1.3 稻谷質量指標檢測

出糙率測定：參照GB/T5495—2008《糧油檢驗 稻谷出糙率檢驗》執行[13]；不完善粒測定：參照GB/T 5494—2008《糧油檢驗 糧食、油料的雜質、不完善粒檢驗》執行[14]；整精米率測定：參照GB/T 21719—2008《稻谷整精米率檢驗法》執行[15]；堊白粒率測定：參照GB/T 17891— 2017《優質稻谷》執行[16]。

1.4 稻米粉品質測定

1.4.1 測試樣品前處理

稻谷樣品經礱谷機脫去穎殼，得到糙米。再將糙米經碾米機碾磨90 s，除去糠粉后，得到加工精度達到國家標準的三級精米[17]。精米經粉碎機粉碎，并過100目篩，用于后續相關指標的測定。

1.4.2 水分含量的測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》(直接干燥法)[18]。

1.4.3 游離脂肪酸值測定

參照GB/T 5510—2011《糧油檢驗 糧食、油料脂肪酸值測定》(石油醚提取法)[19]。

1.4.4 直鏈淀粉含量的測定

參照GB/T 15683—2008《大米 直鏈淀粉含量的測定》[20]。

1.4.5 α-淀粉酶活力測定

采用北京索萊寶科技有限公司生產的α-淀粉酶活性檢測試劑盒。

測試原理：淀粉水解酶催化淀粉水解生產還原糖，還原糖還原3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質，通過測定540 nm吸光度增加速率，計算淀粉酶活性。淀粉酶活力以每g稻谷每分鐘催化產生1 mg還原糖定義為1個酶活力單位。

1.4.6 過氧化物酶活力測定

采用南京建成生物工程研究所生產的過氧化物酶測試盒。

測試原理：利用過氧化物酶催化過氧化氫反應的原理，通過測定420 nm處吸光度的變化得出其酶活性。以每克稻谷每分鐘催化1 μg底物的酶量定義為一個酶活力單位。

1.4.7 脂肪酶活力測定

采用北京索萊寶科技有限公司生產的脂肪酶(LPS)活性檢測試劑盒。

測試原理：LPS催化油酯水解成脂肪酸，利用銅皂法測定脂肪酸生成速率，通過測定420 nm處吸光度的變化，即可計算LPS活性。以每克稻谷每分鐘水解橄欖油生成 1 μmol 脂肪酸為一個酶活單位。

1.4.8 糊化特性的測定

參照GB/T 24852—2010大米及米粉糊化特性測定 快速粘度儀法(RVA)[21]，測定各稻谷樣品的糊化特性的特征值。

1.4.9 X射線衍射測定

采用X射線衍射儀對實驗組與對照組樣品的晶體結構進行檢測，測定條件如下：銅靶，石墨單色器，電壓為40 kV，電流為100 mA，發射狹縫為1°，防散射狹縫為1°，接受狹縫為0.15 mm，2θ掃描區間為5～40°，掃描速度為5(°)/min，2θ/θ連續掃描，步長0.02°，并用MDI JADE6.5軟件計算結晶度[22]。

1.4.10 掃描電子顯微鏡測試

將稻谷樣品導電膠固定在載物臺，噴金處理后，放入樣品腔進行觀察，加速電壓為15 kV，觀察并拍攝樣品的顆粒形貌。

1.5 圖表繪制及數據處理

圖表由Origin Pro 2016繪制，數據由IBM SPSS 22.0進行分析和處理。

2 結果分析

2.1 霉菌對稻谷結塊的影響

稻谷儲存35 d，實驗組與對照組稻谷的表觀形貌如圖1所示。由圖1可觀察到1號、3號、4號實驗組的稻谷存在較明顯的霉變現象，并且整體伴隨著較明顯的結塊現象。2號實驗組部分區域存在霉變，而霉變區域處的少量稻谷存在結塊現象，5號實驗組稻谷的霉變與結塊現象輕微。微生物的繁殖與增長是導致稻谷結塊的一個重要原因[22]，本實驗選用5種較常見的霉菌，對稻谷進行污染的接種處理。在接種霉菌前先對稻谷進行滅菌處理，因此可認定稻谷所接種的霉菌是稻谷期生長初期的優勢菌。

圖1 稻谷表觀形貌

實驗組與對照組稻谷的霉菌生長情況如圖2所示，由圖2可知1號、3號、4號實驗組所接種的霉菌生長較快。該現象與圖1觀察到的稻谷的表觀形貌規律一致，霉菌生長較快的實驗組的稻谷發生了較嚴重的結塊和霉變現象，其余實驗組次之。1、3、4號實驗組所接種的霉菌分別對應為黑曲霉、黃曲霉、產黃青霉，由此可判斷黑曲霉、黃曲霉、產黃青霉較易導致稻谷結塊。雖然在稻谷儲藏的過程中霉菌會發生一定的演替規律，優勢菌也會隨之發生變化，但該實驗結果對稻谷結塊的成因仍具有一定的參考價值。周建新等[23]在研究不同儲藏條件下稻谷霉菌區系演替規律時發現，粳稻谷所含霉菌的優勢菌最終會向黃曲霉、黑曲霉、白曲霉演替，這也一定程度上驗證了黃曲霉、黑曲霉、產黃青霉較易導致稻谷結塊的規律。此外稻谷的結塊還與稻谷的水分含量、環境溫濕度相關，當稻谷的儲藏溫度、濕度及水分含量越高時，稻谷中霉菌繁殖增快并且霉菌菌絲互相連結，形成菌落，稻谷中有機質被逐漸消耗，最終造成稻谷結塊、霉變[24]。

圖2 霉菌生長曲線

2.2 結塊稻谷儲藏品質分析

稻谷質量指標檢測結果如表1所示，對照組的稻谷品質與初始值相比，在出糙率、整精米粒率上略有下降，而不完善粒率有所升高。該結果意味著稻谷在儲藏過程中品質發生了輕微的劣變。再對比于實驗組與對照組的物檢測試結果，實驗組稻谷的出糙率、整精米粒率要顯著低于對照組，并且不完善粒率明顯增加。根據國家優質稻的評判標準分析，三級粳稻谷的整精米率需≥55%，不完善粒率≤5%，實驗組的稻谷均無法達到國家三級粳稻谷的要求。并且在物檢過程中發現實驗組的稻谷脫殼后發現霉變粒、病斑粒、蟲蝕粒的含量顯著增加，因此導致稻谷不完善粒率的增加。另外稻谷出糙率的計算方法為完善粒的質量加上一半不完善粒質再除去測試稻谷的總質量，因而導致實驗組稻谷出糙率的值低于對照組。整精米率是評價稻谷加工品質優劣的重要指標,與碾米廠的經濟效益密切相關。對照組與初始值相比稻谷的整精米率略有降低，是由于稻谷在儲藏過程中呼吸作用使干物質不斷被消耗，從而導致稻谷組織疏松，整精米率下降[25]。實驗組與對照組相比，稻谷的整精米率顯著下降，在物檢過程中發現部分實驗組稻谷通過碾米機后碎米粒較多，因而導致整精米率下降。此外，從表1數據分析發現各個實驗組稻谷的出糙率、不完善粒、整精米率與稻谷的結塊程度呈現一定的相關性，1號、2號、4號實驗組稻谷結塊、霉變程度較大，其出糙率、整精米率與其他實驗組相比略低，而不完善粒率較高。堊白是指稻米淀粉體排列不緊密呈現出的散光不透明部分，是稻米外觀品質的重要影響因素。稻谷中堊白粒的形成主要與水稻的生長環境及品種遺傳相關[26]，從表1的物檢結果中發現，實驗組與對照組及初始值之間并不存在非常顯著的差異，表明稻谷儲藏對堊白粒率的影響并不大。

表1 稻谷質量指標檢測結果

注：初始值為儲藏第0天稻谷樣品的測試結果。數值以平均值±標準差的形式表示，同一列中小寫字母不同表示組別之間存在顯著性差異(P<0.05)，余同。

稻谷儲藏期間酶活性的變化與稻谷品質變化以及稻谷結塊、霉變存在一定的相關性。通過對實驗組與對照組稻谷的酶活力進行測試，有助于從酶活動的角度解釋和分析稻谷結塊、霉變，實驗組與對照組的稻谷品質指標測試結果如表2所示。稻谷中的淀粉酶有3種，分別為α-淀粉酶、β-淀粉酶和異淀粉酶。其中α-淀粉酶對谷物食用品質影響較大。隨著大米儲藏時間的延長，α-淀粉酶活性降低，并且有研究發現α-淀粉酶活性與大米陳化時流變學特性的變化相關[27]。由表2數據可知，對照組與初始值相比淀粉酶的活力降低了0.12 mg/(min·g)，并存在顯著差異，表明淀粉酶的活力會隨儲藏時間的延長而降低[28]。而比較實驗組與對照組淀粉酶活力的數據，實驗組的淀粉酶活力遠遠低于對照組，說明儲藏期間實驗組稻谷的淀粉酶已充分發揮其活性，水解淀粉分子鏈中的α-1,4-糖苷鍵，將淀粉鏈切斷成為短鏈糊精、寡糖和少量麥芽糖和葡萄糖。稻谷中主要的營養成分為淀粉，而α-淀粉酶的活動能夠對淀粉的結構產生一定的影響，推測稻谷結塊可能與淀粉的結構變化有關。此外，發現隨著儲藏時間的延長，實驗組與對照組的直鏈淀粉含量升高，原因是一部分支鏈淀粉在脫支酶的作用下變為直鏈淀粉，直鏈淀粉含量的增加，易導致米飯蒸煮過程中水分難以滲透，制得的米飯口感較硬[29]。

過氧化物酶存在于所有的糧食籽粒中，糧食儲藏過程中口感下降，甚至變苦與過氧化物酶的活性有密切關系。吳金蘭等[30]研究發現大米隨著儲藏時間的延長，過氧化物酶活性不斷減弱，并與大米脂肪酸值上升存在極好的負相關性。而脂肪酶能把脂肪中具有孤立不飽和雙鍵的不飽和脂肪酸氧化為具有共軛雙鍵的過氧化物，是造成酸敗的必然條件[31]。觀察表2數據發現，隨著儲藏時間的延長，實驗組與對照組的過氧化物酶與脂肪酶的活力較初始值相比均下降了，而實驗組的過氧化物酶與脂肪酶的活力要低于對照組并存在顯著差異(P<0.05)。各個實驗組之間，結塊較嚴重的1號、3號、4號實驗組的過氧化物酶與脂肪酶的活力與其余實驗組相比相對較低。脂肪酸值是糧食儲藏過程中品質變化的重要指標之一，一般來說脂肪酸值越高,糧食品質越差。根據國家標準中對稻谷儲存品質的判定，粳稻谷脂肪酸值≤25.0為宜存，≤35為輕度不宜存[16]。表2中對照組的脂肪酸值為18.6 mg KOH/100 g與初始值相比升高了8.2 mg KOH/100 g，但仍符合優質稻谷適宜儲存的評價標準。1號～5號實驗組稻谷的脂肪酸值與對照組相比明顯升高了，存在顯著性差異(P<0.05)，并且大部分稻谷已不適宜繼續儲存。根據上述結果可以得出在稻谷結塊過程中，過氧化物酶和脂肪酶主要是導致稻谷的脂肪酸值升高，而宏觀上則體現為稻谷氣味酸敗和口感變苦。

表2 稻谷品質指標測試結果

2.3 結塊稻谷糊化特性分析

糊化過程中的特征值主要有峰值黏度、崩解值、衰減值、回生值、最低黏度、最終黏度等。這些糊化過程中的特征值可以一定程度上反映淀粉的黏滯特性與米飯的食味品質[23]。稻谷淀粉糊化過程中的特征值如表3所示。崩解值為峰值黏度與熱漿黏度的差值，是衡量米粉熱糊穩定性的指標。此外，繆銘等[33]的研究表明，淀粉總體的崩解值與淀粉的消化性能呈極顯著正相關。稻谷中的淀粉與脂類緊密結合，而隨著儲藏的進行，淀粉粒表面的親水作用減弱，使得體系的抗剪切能力下降，淀粉粒易破裂，因此崩解值下降[34]。因此儲藏35 d的對照組的稻谷的崩解值與初始值相比下降，并存在顯著性差異(P<0.05)。此外，接種霉菌的實驗組崩解值處于1 377.5～1 587.2 cP的范圍，而未接種霉菌的對照組在崩解值約為2 075.0 cP，二者存在著顯著性的差異(P<0.05)，由此可知結塊和霉變的稻谷中的淀粉結構發生了一定的變化，使得淀粉抗剪切能力下降，淀粉粒更易破裂。另外實驗組的峰值黏度與對照組相比偏低，反映出α淀粉酶活性下降，該結果與表2中淀粉酶活性測試結果一致。

消減值為最終黏度與峰值黏度的差值，它反映了米粉冷糊的穩定性和老化性。米飯硬度、黏性與消減值之間存在極顯著的相關性。消減值越大，米飯就越硬，黏性就越小[35]，相對而言品質較差。從表3數據來看，實驗組的消減值處于41.5～296.2 cP的范圍，對照組的消減值約為-433.1 cP。對照組的消減值為負值，遠遠小于實驗組，二者存在著顯著性的差異(P<0.05)。由此可推斷由結塊和霉變的稻谷所制得的米飯，其硬度大，黏性小，整體品質較差。

回生值反映淀粉冷糊的穩定性和老化趨勢。回生值的高低與它們的直鏈淀粉的聚合度和支鏈淀粉的結構有關，直鏈淀粉聚合度高，支鏈淀粉外鏈長的淀粉易于老化[36]。從表3數據分析，對照組與結塊霉變的實驗組之間并沒有存在顯著性的差異。糊化溫度也是用于衡量淀粉品質的一個重要指標，當溫度高于糊化溫度時晶體崩解，淀粉顆粒開始溶脹，黏度突然升高，并逐漸達到峰值黏度。而糊化溫度的大小主要受直鏈淀粉含量、結晶度和支鏈淀粉結構等因素影響。實驗組的糊化溫度處于73.2～75.1 ℃的范圍，對照組的糊化溫度約為71.1 ℃，實驗組稻谷樣品的糊化溫度要略高于對照組，并存在顯著性差異(P<0.05)。一般來說，直鏈淀粉含量與結晶度較高的淀粉晶體結構緊密，晶體熔解所需熱量大，導致糊化溫度較高[37]。

綜上所述，可以合理推測稻谷在結塊的過程中，淀粉的抗剪切能力下降，淀粉粒也更易破裂；直鏈淀粉含量與淀粉結晶度升高，所制得的米飯硬度較大，粘性較小，整體品質較差。

2.4 X射線衍射分析

淀粉結晶度是表征淀粉顆粒結晶性質的一個重要參數，其大小直接影響著淀粉產品的應用性能。而淀粉經過物理、化學或生物處理之后，其結晶度的變化在可以一定程度上反映淀粉顆粒內部結構的變化[38]。由于晶體能對X射線產生衍射效應，因此常利用這種衍射測定淀粉顆粒中晶體結構的信息[39]。X射線衍射測試結果如圖3所示，圖3中實驗組與對照組的X射線衍射測試結果較相似，均在2θ為15°、17°、18°及23°附近表現出強的衍射峰，說明稻谷結塊、霉變前后的淀粉晶體結構沒有發生變化，仍然為A型晶體結構[40]。此外，通過X射線衍射譜圖處理軟件MDI JADE 6.5對測試結果進行淀粉結晶度計算，計算結果在圖3中進行標注。計算發現實驗組與對照組的淀粉在結晶度上存在較明顯的差異，實驗組的淀粉結晶度要高于對照組，并且圖1中稻谷結塊、霉變明顯的實驗組的淀粉結晶度也相對較高。該結果表明在稻谷結塊、霉變后淀粉的結晶度增加，并與結塊稻谷的糊化特性分析中所發現的規律一致，由于淀粉結晶度的增加而導致了淀粉糊化溫度升高。

表3 稻谷淀粉糊化過程中的特征值

圖3 X射線衍射測試結果

2.5 掃描電子顯微鏡分析

本研究采用掃描電子顯微鏡觀察稻谷結塊前后稻米粉(<100目)的顆粒形態變化。掃描電子顯微鏡測試結果如圖4所示，拍攝放大倍數為4 000。由掃描電鏡圖可以看出對照組的稻米粉分散松散，無明顯聚集，并且稻米顆粒表面較光滑、平整(圖4a)。由圖4b～圖4f觀察發現，結塊、霉變實驗組的稻谷顆粒表面凹凸不平，顆粒感強。圖4e觀察到稻谷顆粒表面存在許多孔隙，推測這部分孔隙可能是稻谷所含的微生物分解并吸收稻谷的營養物質所造成的。此外，在掃描電鏡中觀察到圖4c與圖4f微小顆粒的聚集程度要小于圖4b、圖4d、圖4f，宏觀則表現為2號實驗組與5號實驗組的結塊、霉變程度小于其他實驗組。稻米粉的主要成分為淀粉，掃描電鏡圖中所觀察到的微小顆粒也大多為淀粉顆粒，淀粉顆粒的聚集使得淀粉的結晶度增加，這與淀粉糊化特性和X射線衍射的分析結果一致。由此推測微觀層面上稻谷內淀粉結構的變化是引起稻谷宏觀品質變化的重要因素。

注：a～f依次為對照組、1號～5號實驗組。圖4 掃描電子顯微鏡測試結果

3 結論

分析不同微生物對稻谷結塊的影響。將稻谷分別接種黑曲霉、白曲霉、黃曲霉、產黃青霉、灰綠曲霉這5種常見的霉菌，并進行儲藏實驗。研究發現，優勢菌為黑曲霉、黃曲霉以及產黃青霉的實驗組霉菌生長較快，易引起稻谷的結塊。

結塊稻谷儲藏品質分析：結塊的稻谷的出糙率、整精米粒率較低，并且不完善粒率明顯增加，其中結塊稻谷的整精米率<55%，不完善粒率>5%，已無法達到國家三級粳稻谷的要求。

結塊稻谷糊化特性分析：結塊稻谷的崩解值處于1 377.5～1 587.2 cP的范圍，顯著低于對照組(2 075.0 cP)；結塊稻谷的消減值處于41.5～296.2 cP的范圍，顯著高于對照組(-433.1 cP)；結塊稻谷的糊化溫度處于73.2～75.1 ℃的范圍，顯著高于對照組(71.1 ℃)。由此推測結塊的稻谷中的淀粉結構發生了一定的變化，使得淀粉抗剪切能力下降，淀粉粒更易破裂，而所制得的米飯，其硬度大，黏性小，整體品質較差。

結塊稻谷微觀結構分析：結塊稻谷其淀粉結晶度較大并且微觀結構存在淀粉顆粒團聚現象，從而導致了淀粉糊化溫度升高。由此可知微觀層面上稻谷內淀粉結構的變化是引起稻谷宏觀品質變化的重要因素。