光合作用信號途徑調控陸地棉矮化的機理研究

屠小菊 ，汪啟明 ，謝陳靈 ，李詠宇 ，李瑞蓮 *，劉愛玉 *

（1.湖南農業大學理學院,長沙 410128;2.湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128；3.湖南農業大學農學院,長沙 410128）

植物的光合作用是植物體重要的生理生態學特征之一，光合作用的產生是地球能量的直接來源，是人類社會產生和發展的基礎[1-2]。矮化是植物綠色革命中非常重要的表型，矮化突變體具有抗倒伏、適宜密植及機械化生產、具有較高生產潛能的特征[3-5]。棉花具有無限生長的習性，目前棉花生產仍然需要人工打頂控制棉花的株高，大面積植棉區如新疆主要利用噴施縮節胺來代替人工打頂，但是縮節胺的使用嚴重污染自然環境。因此，培育矮化品種不僅可以給生產帶來很多的便利，而且可以減少對環境的污染[6]。研究表明，植物光合作用信號傳導途徑相關基因的變化改變植物的光合特性，從而導致植物矮化。Rojas-González 等[7]發現擬南芥中光合作用途徑的重要元件 cfbp1、cyfbp 的單基因以及雙基因的T-DNA 插入突變體均表現出矮化的表型，突變體的光合速率也降低。Chen 等[8]將柳樹LEA基因導入到楊樹中，得到楊樹矮化突變體dw1，其光合作用相關基因發生明顯變化。Hu 等[9]通過對蓖麻矮化突變體Zhebi26 及高稈材料Zhebi100的研究發現，Zhebi26 中光合作用相關的蛋白質表達量下降，凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Cond）、胞間CO2濃度（Ci）均顯著降低，葉綠素熒光參數初始熒光（F0）、可變熒光產量（Fv）、光系統 II（PS II）最大光化學效率(Fv/Fm）、光化學猝滅系數（qP）均顯著小于Zhebi100。

光合作用是植物體干物質的來源，通過對植物體光合特性的測定，能夠詳細了解植物體生長特征，對指導生產、調控植物體的生長具有重要的意義[10]。目前，關于棉花矮化突變體光合特征的研究鮮有報道。黃華宏等[11]的研究發現矮生杉木的光合能力缺陷可能是造成其低生長勢的重要生理生態原因之一，其Pn、Cond及蒸騰速率（Tr）均低于正常型，葉綠素熒光參數中F0、最大熒光（Fm）、Fv/Fm及 PS II 的潛在活性（Fv/F0）均小于正常型。棉花sda矮化突變體的葉綠素含量、SPAD值及Pn較野生型（WT）均顯著減少[12]。王靜靜[13]發現矮化雜交蘭突變體中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均顯著低于正常雜交蘭植株，其Pn和Tr顯著降低，Ci顯著增高，葉綠素熒光非光化學猝滅（NPQ）也顯著高于正常雜交蘭植株。

本研究以陸地棉矮化突變體LA-1 及其近等基因系LH-1 為材料，以同位素標記相對和絕對定量（Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ） 結合液相質譜串聯（LC-MS/MS）的定量蛋白質組學的結果為切入點，找到光合作用信號傳導途徑中差異表達蛋白，比較兩種材料光合特性的差異，進一步明確LA-1 矮化與光合作用的相關性，為LA-1 在棉花矮化育種中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為陸地棉矮化突變體LA-1 及其近等基因系LH-1，均為湖南農業大學棉花研究所自育材料。前期的研究表明，在現蕾前LA-1 與LH-1具有相同的生長趨勢； 進入現蕾期后LA-1 生長緩慢，逐漸表現出矮化表型，停止生長時間早；LA-1 在盛花期后伸長節間基本固定，表現為有限生長習性，兩種材料表型差異出現在現蕾期[14]。

1.2 試驗方法

1.2.1材料種植及試驗設計。田間試驗于2016年4月到8月在湖南農業大學瀏陽試驗基地完成，室內試驗于湖南農業大學作物生理與分子生物學教育部重點實驗室完成。4月28日直播，種植密度 4 株·m－2，小區面積 20 m2，對比試驗，5 次重復，小區左右交叉排列。不施基肥，4 葉期（5月25日） 一次性施肥，N、P2O5、K2O 用量分別為180、90、180 kg·hm－2。

1.2.2棉花蛋白質組學分析。分別選取播種86 d后（現蕾期，此時兩種材料株高差異達到顯著[14]）LA-1 及LH-1 的主莖莖尖為材料，兩種材料莖尖分別來自于60 株相互獨立的植株，這些材料被隨機分為三組，用液氮凍融后放入－80 ℃冰箱中保存備用，按照前期的研究方法進行蛋白的提取及iTRAQ 定量蛋白質組學分析[14]。

1.2.3定量反轉錄- 聚合酶鏈式反應（Quantitative reverse-polymerase chain reaction,qRT-PCR）分析。用于qRT-PCR 的植物材料與iTRAQ 定量蛋白質組學的材料相同，按照前期的研究方法進行 RNA 的提取及逆轉錄[14]。根據 iTRAQ 定量蛋白質組學的檢測結果，選取光合作用信號途徑差異表達蛋白，根據其序列設計qRT-PCR 引物，以棉花內標準基因ACT（Actin）為對照，引物序列如表1。用qRT-PCR 檢測這些基因在兩種材料中的相對表達水平。反應儀器是Roche Light Cycler 480Ⅱ，溫度循環參數為95 ℃，預變性10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

表1 光合作用相關表達差異蛋白基因引物Table 1 Primers of photosynthesis related different expression proteins

1.2.4葉綠素含量測定。以現蕾期LA-1 及LH-1為材料，每小區隨機選取連續5 株棉株的主莖倒4 葉進行測定。葉片剪碎后加入碳酸鈣研磨，采用乙醇浸提方法，使用上海光譜SP-754 分光光度計，測定樣品在645 nm 和663 nm 下的吸光度。計算葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素的濃度，每個材料3個重復。

1.2.5SPAD 值的測定。選取與葉綠素測定同一時間的兩種材料的主莖倒4 葉，采用便攜式SPAD 儀測定SPAD 值，每小區隨機選取5 株進行測定，每片葉重復測定3 次。

1.2.6光合參數的測定。采用Li-6400 便攜式光合測定儀（LI-COR，美國），分別于棉花現蕾期前及現蕾期有表型差異后對兩種材料進行光合參數測定，選擇光合活性強的主莖倒4 葉。每小區隨機選取5 株進行測量，所有材料的測定時間選擇晴朗的上午8∶00―11∶00，光量子通量密度（Photosynthetic photo flux density，PPFD） 設為1 000 μmol·m2·s－1，流速 （Flow） 設定為 500 μmol·m2·s－1。測量時提前進行預熱，使儀器工作穩定后開始測量，每間隔 30 min 匹配（Match）1次，減小測量誤差，測定的參數包括Pn、Cond、Ci和Tr。

1.2.7葉綠素熒光參數測定。以現蕾期LA-1 及LH-1 為材料，每小區隨機選取連續5 株有代表性的棉株的主莖倒4 葉，采摘后立刻用濕毛巾包裹，帶回室內，暗適應30 min。采用調制葉綠素熒光成像系統 IMAGING-PAM 2000（Walz，德國）預先編好的測定程序Ind.Curve （暗- 光誘導曲線） 測定葉綠素熒光參數，包括F0、Fm、Fv/Fm、Fv／F0、NPQ、qP、非光化學猝滅系數（qN）和 PS II 實際光合效率（YII）。適宜測量光強的選擇：利用備用的棉花葉片，調節Meas.light（測量光），使測量區域 （Area of interest,AOI） 的實時熒光 （Ft）在0.1～0.15 之間，調節 Act.light（光化光），使ΔF值在Fv的 1/3～2/3 內。光強選擇完成之后開始測量，測量過程中 Meas.light、Act.light 不再進行更改。

1.2.8統計方法。圖表通過Excel 軟件進行制作，通過DPS 軟件進行單因素方差分析。PS II 實際光合效率YII＝（Fm′－F）/Fm′，葉綠素熒光非光化學淬滅（NPQ）=（Fm－Fm′）/Fm′，光化學猝滅系數qP＝（Fm′－F）/ （Fm′－F0′），非光化學猝滅系數qN＝（Fm—Fm′）/（Fm－F0′）。其中，Fm′為光下最大熒光，F為熒光產額，F0′為光下最小熒光產額。

2 結果與分析

2.1 光合作用途徑相關差異表達蛋白

通過對LA-1 及LH-1 兩種材料進行iTRAQ定量蛋白質組學分析得到一系列差異表達蛋白[14]，然后將差異表達蛋白進行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，http://www.kegg.jp/）富集分析，從而獲得了參與光合作用信號途徑的差異表達蛋白。通過分析發現光合作用途徑共存在7 種差異表達蛋白，其中5 種在LH-1 中上調，包括PSⅡ外周小亞基蛋白PsbO、光系統I（PS I）亞單位 IV 蛋白 PsaE、PS I 亞單位 VI 蛋白 PsaH、鐵氧化還原蛋白PetF-1 和PetF-2；2 種下調，包括細胞色素b6/f復合體 （Cytochromeb6f,Cytb6f）中的鐵硫亞基 PetC、F 型 ATP 合酶（F-type ATPase）亞基delta（圖1，表2）。存在于光合作用途徑的上述7 種差異表達蛋白均在植物光合作用電子傳遞鏈中發揮重要的作用，其中PsbO 是PS II 的錳穩定蛋白；PsaE 能夠直接錨定鐵氧還原蛋白，在循環電子傳遞中發揮作用；PsaH 蛋白能夠將能量從捕光色素蛋白復合物II （LHC II） 傳遞到PS I反應中心；PetF 是光合系統電子傳遞鏈中的第一個基質的電子接受者，主要負責電子傳遞；ATP合酶由F1和F0兩部分組成，其中F1伸在膜外，具有水溶性，F0則嵌在膜內，delta 亞基對F1和F0的連接是至關重要的[10]。由于這些蛋白在兩種材料中表達差異，會對兩者的光合能力產生影響。這些差異蛋白的發現說明LA-1 矮化與植物光合效率存在聯系。

圖1 光合作用途徑差異表達蛋白Fig.1 Differential expressed proteins in photosynthesis pathways

表2 光合作用途徑差異表達蛋白Table 2 Differential expressed proteins in photosynthesis pathway

2.2 葉綠素含量及SPAD值差異

LA-1 及LH-1 細胞色素含量存在差異，與LH-1 相比，LA-1 的葉綠素a 及葉綠素的總含量均小于LH-1（表3），其中，葉綠素a、總葉綠素含量分別減少了10.53%和10.67%，差異均達到顯著水平（P＜0.05），葉綠素b 及類胡蘿卜素含量無顯著性差異。SPAD 值的測定方法具有高效、簡便、損傷小的特點，目前廣泛應用于各種植物中。植物葉片的SPAD 值一般與葉綠素含量呈極顯著正相關的關系[15]，因此對兩種材料SPAD 值的測定能在一定程度上反映葉綠素的水平。結果表明，LA-1 的 SPAD 值顯著小于LH-1（P＜0.05）（表3）。綜上，LA-1 的葉綠素 a、總葉綠素含量及SPAD 值均顯著小于LH-1。

表3 LA-1 及LH-1 葉綠素含量及SPAD 值差異Table 3 Differences chlorophyll content and SPAD between LA-1 and LH-1

2.3 光合特性差異

通過對兩種材料現蕾期前后光合特性的比較，從而進一步深入了解兩種材料生長差異性的光合作用特征。結果表明，現蕾前，兩種材料Pn差異不顯著，但是Cond、Ci以及Tr存在差異，其中，與LH-1 相 比 ，LA-1 的Cond、Ci分 別 減 少 了9.41%和2.49%，而Tr增大了17.72%，差異均達到顯著水平（P＜0.05）（表 4）。矮化突變體LA-1通過較低的Cond和Ci及較高的Tr來增強光合作用效率，從而使其具有與LH-1 大約一致的光合效率，因而在現蕾前與LH-1 保持一致的生長趨勢。在現蕾后，與LH-1 相比，LA-1 的Pn、Cond、Tr均減少，其中Pn減少了 12.19%，Cond減少了35.64%，差異均達到顯著水平（P＜0.05），Tr減少27.81%，差異達到極顯著水平（P＜0.01），但是Ci無顯著性差異（表 4）。LA-1 的Pn、Cond及Tr出現明顯小于LH-1 的現象，從而使得LA-1 的氣體交換的速率明顯降低，導致光合效率降低。在一定的光照強度下，植物的凈光合速率可直接反映其光合積累有機物的能力。LA-1 在現蕾后Pn顯著小于LH-1，導致LA-1 在現蕾后生長速度較LH-1 慢，從而導致LA-1 矮化，表明LA-1 植株矮化表型與光合特性存在聯系。

表4 不同時期LA-1 及LH-1 光合特性的差異Table 4 Differences in photosynthesis parameters between LA-1 and LH-1 in different growth periods

2.4 葉綠素熒光參數差異

與LH-1 相比，LA-1 的YII減少了 23.17%，Fv/F0減少了 24.04%，NPQ增加了 16.18%，差異均達到顯著水平（P＜0.05），但是F0、Fm、F0′、Fm′、Fv/Fm、qP和qN 無顯著性差異（表 5）。LA-1 的YII及Fv/F0的值小于LH-1，說明LA-1 合成的光合產物較少，另一方面作為非光化學淬滅的NPQ反映天線色素系統對激發能的熱耗散；LA-1 的NPQ顯著大于LH-1，這說明LA-1 中有更多的光能被用于熱耗散，從而使得用于光合作用的能量較LH-1 少，這也是導致LA-1 具有較低的實際光合效率，從而導致矮化的另一個原因。

2.5 qRT-PCR檢測相關基因mRNA水平表達

選取光合作用信號途徑差異表達蛋白，進行qRT-PCR 檢測其mRNA 水平表達。結果表明，除了delta基因的表達量與蛋白質組學的結果不一致外，其他的基因表達量與蛋白質組學的結果具有一致性。與LH-1相比 ，PsbO、PsaE、PsaH、PetF-1 及PetF-2 在LA-1 中的表達量均減少，其中 ，PsbO、PsaE及PsaH分別減少了48.75% 、34.40%和 25.49%；PetF-1和PetF-2 的表達量的變化最大，在LA-1 中分別減少了 62.29%和69.24%；PsaE和PsaH表達量差異達到顯著水平（P＜0.05）；PsbO、PetF-1 及PetF-2 的表達量差異達到極顯著水平 （P＜0.01）；PetC表達量增加了91.82%，差異達到極顯著水平（P＜0.01）。但是，delta的表達量在兩種材料中差異不明顯（圖2）。結果表明，PsbO、PsaE、PsaH、PetF-1、PetF-2 及PetC基因的轉錄后調控與基因表達不相關，delta的表達量可能存在轉錄后調控的現象。

表5 LA-1 及LH-1 葉綠素熒光參數比較Table 5 Comparison of chlorophyll fluorescence parameters between LH-1 and LA-1

圖2 qRT-PCR 檢測光合作用相關基因表達Fig.2 qRT- PCR of photosynthesis related genes

3 討論

3.1 光合作用差異表達蛋白與LA-1矮化的相關性

目前，關于采用蛋白質組學的方法研究植物矮化機理的報道不多見，本研究通過iTRAQ 定量蛋白質組學的研究表明，共有7個參與光合作用的蛋白表達量在LH-1 及LA-1 中存在差異。除PetF基因沒有調控植物體高度的報道、單個PetC亞基的缺失不會對植物表型有影響外，其他幾個差異表達基因均和植物體的生長有關，其中任何一個基因的缺失都能導致植物體的生長受阻。PsbO 是PS II 系統的重要組成成分，是PS II 的錳穩定蛋白[16-18]。Murakami 等[19]研究表明擬南芥含有 2個PsbO基因，分別為PsbO1和PsbO2，PsbO1 缺失突變體中PsbO1 基因的缺失導致PS II活性降低從而表現出生長阻滯的表型，PsbO1 比PsbO2 發揮更重要的作用，但是PsbO2 同樣在PsbO1 缺失突變體中的表型變化發揮作用。PsaE是PS I 的重要組成部分，能夠直接錨定鐵氧還原蛋白，在循環電子傳遞中發揮作用[20-22]。Varotto 等[23]發現擬南芥PsaE基因缺失突變體Psae1 的光敏感度增加，表現出光抑制現象及植物高度降低50%的表型。結果表明，PsaE基因通過調控光合作用，與植物的生長密切相關。Naver 等[24]研究表明PsaH 是PS I 穩定積累及有效電子傳遞必需的，PsaH轉基因植物含有PsaH 的含量比野生型少3%，在無菌培養基上生長比野生型小，與野生型相比缺少PsaH 的PS I 復合物，只有61%的輔酶 II（NADP+）光還原活性。Schneider 等[25]發現在集胞藻屬中 PetC 蛋白包括 3個亞基 PetC1、PetC2 和PetC3，其中任何一個亞基的刪除都不會明顯地影響集胞藻屬的表型。通過對擬南芥delta基因的干擾和抑制的研究發現，delta在擬南芥的配子形成中發揮重要作用，delta缺失導致擬南芥線粒體代謝活躍程度降低，從而使植株生長減弱及配體發育缺陷[26]。

到目前為止，關于本研究中涉及的光合作用差異表達基因調控植物矮化的研究較少，在棉花中還未見報道，作為光合作用過程的重要組成元件，蛋白表達水平的變化在一定程度上能夠反應植物光合能力的強弱。本研究發現PsbO、PsaE、PsaH、PetF-1、PetF-2 蛋白的表達量在LA-1 中下調，PetC、delta蛋白在LA-1中上調（圖1）。qRT-PCR 的結果表明，基因轉錄水平的表達與蛋白質組學的表達存在一定的差異，delta基因在兩種材料中差異不明顯，PetC基因在LA-1 中的表達量極顯著大于LH-1，但是由于單一PetC基因的刪除對植物生長不會產生顯著的作用，所以PetC基因在LH-1 中表達量低并不會顯著影響LH-1 的表型。因此，在LA-1 中表達量下調的上述5個蛋白可能通過影響光合作用效率和生物體中的其他途徑，從而導致LA-1 的矮化，這從基因及蛋白表達水平進一步解釋了LA-1 矮化的原因。但是具體是哪個基因在此過程中發揮主要作用，發揮作用的具體機理，還有待進一步采用分子生物學的手段來做更加深入地研究。

3.2 LA-1光合色素及光合效率降低導致矮化

目前，關于矮化突變體光合能力的檢測主要集中在果樹中，關于棉花的研究很少，張超等[27]的研究發現棉花矮化突變體AS98 表現出極端矮化的表型，其凈光合效率顯著小于正常棉花品種。葉綠素含量的大小反映葉片的生理活性的大小，是植物生長發育中的一個重要指標，在一定程度上反映植物光合能力的強弱。本研究中，LA-1 的葉綠素a、總葉綠素含量及SPAD 值均顯著小于LH-1，這在一定程度上導致LA-1 的光合作用能力較LH-1 弱，從而導致LA-1 的矮化。LA-1 在現蕾前與LH-1 的Pn無顯著差異，兩者光合能力相似，因此，在現蕾前兩者的植株高度無顯著的差異，現蕾后LA-1 的光合能力顯著降低，導致其光合產物的生產能力較弱，從而導致矮化，雖然LA-1 的光合能力較LH-1 弱，不利于光合產物的積累，但是在生產中可以通過高度密植的方式增加其單位面積的光合產物的積累。并且矮化棉花適宜機械化生產，因此在生產中具有重要的應用價值。

4 結論

本研究通過iTRAQ 定量蛋白質組學及qRT-PCR 的方法，結合一系列生理學檢測，發現光合作用信號途徑差異表達蛋白PsbO、PsaE、PsaH、PetF-1 及 PetF-2 在LA-1 中表達量下調。PetC 和delta 表達量在LA-1 中上調。上述蛋白的差異表達會導致LA-1 光合能力下降。這些研究結果說明LA-1 光合作用相關蛋白的表達量降低，導致其光合能力降低，從而導致其矮化，陸地棉矮化突變體LA-1 的矮化與光合作用途徑存在相關性，為進一步研究LA-1 矮化的分子機理及棉花的矮化育種提供理論基礎。