超高效液相色譜-差分離子淌度質譜法測定化妝品中10種卡因類禁用組分

連顯會 王春 孟憲雙 白樺 孫小杰 薛宏宇 馬強

摘?要?建立了化妝品中10種卡因類禁用組分的超高效液相色譜-差分離子淌度質譜測定方法。以正十二醇為萃取劑、四氫呋喃為分散劑在水中自組裝形成超分子溶劑，并結合渦旋輔助對化妝品試樣進行分散液液微萃取。考察了超分子溶劑的組成、用量及渦旋時間等參數對萃取效率的影響，以及差分離子淌度質譜對同分異構體的分離效果。結果表明，試樣在4 mL正十二醇-四氫呋喃超分子溶劑中渦旋振蕩3 min即可完成高效萃取，且可有效去除基質干擾，降低基質效應。差分離子淌度質譜在優化的載氣、分離電壓、補償電壓等條件下可將色譜難以分離的同分異構體（苯佐卡因和三卡因）實現淌度分離，解決了兩種同分異構體由于色譜無法分離而不能準確定性和定量分析的問題。10種卡因類組分在各自濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.99，方法檢出限為0.2～8.0 μg/kg，方法定量限為0.4～20.0 μg/kg。在低、中、高3個添加水平下的平均回收率為70.7%～94.7%，相對標準偏差為1.2%～12.7%（n=6）。本方法步驟簡便、 快速高效，適用于化妝品中10種卡因類禁用組分的同時分析測定。

關鍵詞?超分子溶劑; 分散液液微萃取; 化妝品; 差分離子淌度質譜

1?引 言

隨著社會經濟的發展和人民生活水平的提高，化妝品已經成為日常生活用品[1]，其質量安全也越來越受到消費者的關注[2]?；瘖y品通過皮膚吸收發揮美白、祛痘等功效，且長期與人體直接接觸，使用過程中化妝品含有的化學危害物質會危害人體健康安全。為確?；瘖y品質量安全，開發化妝品中禁限用物質的檢測方法尤為重要。普魯卡因、苯佐卡因、丁卡因等組分是臨床上常用的局部麻醉藥，可能添加于曬后修復、祛斑、祛痘、去角質層、去皺/抗衰老等化妝品中，以達到減輕人體肌膚疼痛或不適的作用，并具有抗皺/抗衰老作用。但其具有中樞神經毒性和心血管毒性，由于人體肌膚毛細管豐富，容易被吸收并迅速進入血液循環，對人體健康造成嚴重危害[3]。因此，我國《化妝品安全技術規范》（2015年版）[3]、歐盟化妝品法規[4]及東盟化妝品指令[5]明確將普魯卡因等卡因類化學物質列為化妝品中禁用組分。

樣品前處理方法很大程度上決定了分析檢測方法的靈敏度和準確性。目前，針對化妝品樣品的前處理方法包括液液萃取[6，7]、固相萃取[8，9]等，但這些方法有機溶劑用量大、分析周期長、測試成本高，此外也會對實驗人員和環境產生負面影響。因此，有必要發展快速高效、操作簡便、綠色環保的前處理技術。超分子溶劑（Supramolecular solvent， SUPRAS）是指由兩親性化合物通過兩相或分子間有序的自組裝過程形成的一種具有納米結構的膠束聚集體[10]。超分子溶劑萃取技術是由西班牙學者Rubio等[11]提出的一種以超分子溶劑為萃取劑的新型萃取技術，通常以烷基醇或烷基酸與四氫呋喃及水混合，形成不溶于水的反向膠束。與其它類型超分子相比，基于反向膠束的超分子溶劑最大優勢在于溶劑中含有較高濃度的兩親化合物，在分析液體樣品時可獲得較高的濃度因子，其萃取作用主要體現在高疏水烷基鏈提供的疏水作用和親水基團提供的氫鍵作用，且烷基鏈越長，疏水作用越占優勢，特別適合萃取疏水性化合物[12～14]。

離子淌度作為一種氣相電泳分離技術，其原理是離子在施加電場和惰性氣體所形成的屏障腔體內進行遷移，離子在遷移過程中因價態、離子大小以及結構不同實現分離[15]。離子淌度質譜是離子遷移譜與質譜聯用的一種新型分析技術，與單獨使用質譜相比，該技術在離子源和質量分析器之間增加離子遷移管，使得待測離子經過預分離后進一步被質譜檢測[16]。差分離子淌度質譜（Differential mobility spectrometry-mass spectrometry， DMS-MS）的離子淌度池由兩個平行的金屬板組成，作為離子遷移場區，離子通過氣體流引入質譜系統，離子淌度池位于四極桿和錐孔之間，可在大氣壓條件下運行，并能夠兼容質譜的所有掃描模式，具有設計簡單、拆裝無需破壞質譜真空系統等特點[17]，在化合物異構體分析[18]、降低基質效應[19，20]等方面顯示出獨特的優越性。

本研究以正十二醇為萃取劑、 四氫呋喃為分散劑，在水中自組裝形成超分子溶劑，結合渦旋輔助對化妝品試樣進行分散液液微萃取，建立了化妝品中10種卡因類化合物的超高效液相色譜-差分離子淌度質譜分析方法（圖1）。本方法萃取效率高、基質效應低，且通過優化載氣、分離電壓及補償電壓等條件將色譜難以分離的同分異構體苯佐卡因和三卡因實現淌度分離，解決了兩種同分異構體共存時無法定性和定量分析的難題，適用于化妝品中10種卡因類組分的同時分析測定。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）; QTRAP 6500+差分離子淌度質譜儀（美國SCIEX公司）; MS-H-Pro 數顯型磁力攪拌器（北京大龍興創實驗儀器有限公司）; Milli-Q Integral 5型超純水儀（美國Merck Millipore公司）; AB204-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）; CR 21N高速冷凍離心機（日本Hitachi公司）; MS3型渦旋振蕩器（德國IKA公司）; 甲醇、乙腈和四氫呋喃（色譜純，美國Fisher公司）; 正戊醇、正己醇、正辛醇、正癸醇、正十一醇、正十二醇（百靈威科技有限公司）; 正庚醇、正壬醇（日本TCI公司）。

10種卡因類化合物標準物質： 普魯卡因（CAS 59-46-1）購自日本TCI公司; 苯佐卡因（CAS 94-09-7）、鹽酸氯普魯卡因（CAS 3858-89-7）購自北京曼哈格生物科技有限公司; 利多卡因（CAS 137-58-6）、三卡因（CAS 582-33-2） 購自百靈威科技有限公司; 丁卡因（CAS 94-24-6）購自德國Dr. Ehrenstorfer公司; 阿米卡因鹽酸鹽（CAS 532-59-2）、布他卡因硫酸鹽（CAS 149-15-5）購自加拿大TRC公司; 利索卡因（CAS 94-12-2）、普莫卡因鹽酸鹽（CAS 637-58-1）購自美國Stanford Chemicals公司，純度均大于98%。

2.2?實驗方法

2.2.1?標準溶液的配制?準確稱取10種卡因類化合物標準品各10 mg（精確至0.1 mg），用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液。分別取10種物質標準儲備溶液，配制成100 g/mL的混合標準儲備液，4℃保存。以甲醇逐級稀釋成系列濃度的標準工作溶液，現用現配。

2.2.2?超分子溶劑的制備?移取1.5 mL正十二醇和8 mL四氫呋喃，迅速注入50 mL玻璃離心管中，加入30.5 mL超純水，420 r/min磁力攪拌3 min后， 3000 r/min離心10 min，用玻璃注射器移取上層有機相于玻璃瓶中，4℃下密封保存。典型的超分子溶劑自組裝過程如圖2所示。

2.2.3?樣品處理?稱取0.20 g試樣（精確至0.01 g）于離心管中，加入4 mL超分子溶劑，渦旋振蕩3 min后，以3000 r/min離心10 min，移取上層液體200 μL，加入200 μL甲醇，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜后，供超高效液相色譜-差分離子淌度質譜測定。

2.2.4?超高效液相色譜-差分離子淌度質譜條件?（1）色譜柱?ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm × 2.1 mm， 1.7m）; 流速： 0.3 mL/min; 流動相： 碳酸氫銨溶液（pH=9）（A）和乙腈（B）。（2）梯度洗脫程序?0～4.0 min，35%～90% B; 4.0～?4.5 min，90% B; 4.5～4.6 min，90%～35% B; 4.6～6.0 min，35% B; 柱溫： 30℃; 進樣量： 5 L。（3）電噴霧質譜?電噴霧離子源; 正離子掃描; 離子源溫度： 150℃; 噴霧電壓： 5500 V; 氣簾氣流速： 30 psi，霧化氣流速： 60 psi，脫溶劑氣流速： 60 psi; 脫溶劑氣溫度： 600℃; 差分離子淌度溫度： 225℃; 多反應監測（MRM）模式; 10種卡因類化合物優化的差分離子淌度質譜分析參數見表1，多反應監測色譜圖見圖3。

3?結果與討論

3.1?超分子溶劑萃取條件的優化

3.1.1?烷基醇種類及用量的優化?選擇具有兩親性的四氫呋喃分別與一系列不同碳原子數的烷基醇（正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇和正十二醇）組合生成超分子溶劑，對卡因類化合物進行萃取。超分子溶劑的萃取作用力主要體現在烷基鏈提供的疏水相互作用和親水頭基提供的氫鍵作用。如圖4A所示，正十二醇/四氫呋喃/水超分子溶劑體系對10種卡因類化合物的萃取回收率為67.6%～95.1%，且回收率較穩定。正辛醇雖對部分物質萃取效果較好，回收率為64.1%～94.7%， 但對丁卡因及布他卡因的萃取效果較差，回收率僅為52.6%和42.6%，因此，選擇正十二醇/四氫呋喃/水作為超分子溶劑體系?？疾炝苏加昧糠謩e為1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 mL（保持溶劑總體積為40 mL）時樣品的回收率，結果見圖4B。當正十二醇用量≥1.5 mL時，樣品的回收率較高且穩定。因此，正十二醇的用量選擇為1.5 mL。

3.1.2?四氫呋喃用量的優化?作為超分子溶劑的重要組成部分，四氫呋喃起到溶解兩親物質使其在水中分散的作用。超分子溶劑的形成與正十二醇、四氫呋喃和水的比例有關。如四氫呋喃比例過低，正十二醇會析出形成沉淀; 如比例過高，四氫呋喃分散在水溶液中，體系不能實現分層。考察了四氫呋喃用量分別為2、4、6、8、10、12和14 mL（保持溶劑總體積為40 mL）時樣品的回收率，結果見圖4C。各目標物在8 mL四氫呋喃時回收率為79.0%～101.5%，且結果穩定，在其它用量時結果較為分散。

3.1.3?超分子溶劑用量的選擇?考察了不同體積超分子溶劑（2、3、4、5和6 mL）對萃取效率的影響，由圖4D可見，隨著所加入超分子溶劑體積不斷增加，萃取效率多呈現先增加后逐漸趨于平穩的趨勢，當超分子溶劑體積達到4 mL 時，10種卡因類物質都有較高的回收率，超過4 mL時，萃取效率達到穩定狀態。因此，選擇超分子溶劑最佳用量為4 mL。

3.1.4??渦旋時間的優化?在超分子溶劑分散液液微萃取中， 引入渦旋振蕩可促進超分子溶劑與目標物的充分混合，以便形成良好的乳濁液狀態，促進傳質過程?？疾炝藴u旋時間分別為1、3、5、7、9、11和13 min時樣品的回收率（圖4E）。隨渦旋時間的延長，回收率并無明顯變化。當渦旋時間為3 min時，10種物質的回收率≥70%，且時間較短。因此，選擇渦旋時間為3 min。

3.2?流動相的選擇

分別考察了反相色譜常用的有機相溶劑甲醇和乙腈與不同pH值（3、4、5、6、8、9和10）的緩沖溶液（酸性pH值用甲酸調節5 mmol/L乙酸銨溶液，堿性pH值用氨水調節5 mmol/L碳酸氫銨溶液）組成的流動相體系，對目標化合物的色譜分離行為和離子化效果的影響，結果表明，乙腈-碳酸氫銨溶液（pH=9）獲得了最為理想的色譜峰形和分離效果，且質譜信號響應較強。

3.3?差分離子淌度質譜參數的優化

通過色譜分離技術難以將同分異構體苯佐卡因和三卡因完全基線分離（圖5A），因此，在方法應用中，無法對二者進行精準的定性及定量分析。本研究通過差分離子淌度質譜技術對二者進行淌度分離，在開啟差分離子淌度質譜功能后，電噴霧離子源及多反應監測參數無需改變，通過直接注射1 μg/mL的混合標準溶液進行差分離子淌度質譜相關參數優化。結果表明，在引入甲醇、乙腈及異丙醇作為修飾劑時，改變分離電壓及補償電壓均不會增加同分異構體苯佐卡因和三卡因的分離度。通過優化未引入修飾劑下的差分離子淌度質譜溫度、分離電壓及補償電壓進行兩種同分異構體分離，經詳細優化上述參數，10種卡因類化合物的分離電壓和補償電壓值見表1，補償電壓淌度分離圖譜見圖5B。經差分離子淌度質譜條件優化后，苯佐卡因和三卡因實現完全淌度分離。三卡因在補償電壓為1.7 V和苯佐卡因在補償電壓為7.0 V時的多反應監測色譜圖分別見圖5C和5D，可由此實現同分異構體的分離。

3.4?基質效應的考察

由于化妝品基質復雜，與卡因類化合物共流出組分可能會影響電噴霧效果，并對待測物信號產生增強或抑制，進而影響測定結果的精密度和準確度。對基質效應進行了考察，10種卡因類物質的基質效應為84.7%～103.0%（圖6），表明采用超分子溶劑分散液液微萃取前處理方法處理化妝品樣品可有效消除基質效應的影響[21，22]。

3.5?方法的分析性能

在優化的條件下，測定一系列不同加標水平的樣品，以峰面積（y）對質量濃度（x）進行線性回歸，繪制標準工作曲線。結果表明，10種卡因類組分在各自濃度范圍內呈良好線性關系（r>0.99）; 分別以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）計算方法的檢出限和定量限，檢出限為0.2～8.0 μg/kg， 定量限為0.4～20.0 μg/kg（表2）。

選擇膏霜類和水劑類化妝品空白樣品，分別在20～100 g/kg范圍內添加低、中、高3個水平的混合標準溶液，按照優化的方法進行分析測定，每個水平平行操作6次，計算回收率。結果表明，10種卡因類物質的平均回收率為70.7%～94.7%，相對標準偏差為1.2%～12.7%（表3）。

3.6?與已有方法比較

表4列出了本方法與文獻報道的檢測方法的比較結果。與傳統的液液萃取法和固相萃取法相比，本方法檢出限與之相當，但樣品前處理相對簡便，萃取和凈化過程同時完成，避免了因繁瑣操作步驟和較長前處理時間引入的實驗誤差。本方法采用差分離子淌度質譜技術，將色譜難以分離的苯佐卡因和三卡因同分異構體實現了淌度分離，有助于解決同分異構體的定性與定量分析難題。

3.7?實際樣品分析

對市售的9件水劑類化妝品樣品及9件膏霜類化妝品樣品進行分析檢測，結果表明，有1件水劑類樣品和1件膏霜類樣品檢出普魯卡因，含量分別為3.39 mg/kg和4.84 mg/kg。以1種含有利多卡因的林可霉素利多卡因凝膠外用非處方藥劑作為待測樣品進行了分析測定，檢測含量與其標示含量相符。

4?結 論

采用超分子溶劑分散液液微萃取結合超高效液相色譜-差分離子淌度質譜技術，建立了化妝品中10種卡因類禁用組分的分析方法。分別對烷基醇的種類與用量、四氫呋喃用量、超分子溶劑加入量和渦旋時間等因素進行了優化考察，并且通過差分離子淌度質譜技術實現了苯佐卡因和三卡因同分異構體的淌度分離。實驗結果表明，此方法準確可靠、操作簡便、溶劑消耗量少，且解決了苯佐卡因和三卡因同分異構體的分離難題，適用于化妝品中10種卡因類禁用組分的同時分析測定。

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