基于聚乙二醇非對稱修飾金納米粒子的鋁離子比色檢測方法

陳心悅 哈偉 師彥平

摘?要?制備了聚乙二醇和檸檬酸鈉不對稱修飾的大尺寸金納米粒子（AuNPs）， 利用檸檬酸根與Al3+之間的螯合作用促使粒子發生定向團聚， 實現了比色法檢測Al3+， 方法高效、準確、穩定。首先， 制備不同粒徑的檸檬酸鈉修飾AuNPs（13、26和38 nm）， 考察了粒子尺寸與比色法檢測Al3+的靈敏度之間的關系， 結果表明， 增大粒徑可顯著提高檢測靈敏度， 其中38 nm AuNPs裸眼檢測Al3+的檢出限可達1 μmol/L;隨后， 將38 nm檸檬酸鈉修飾AuNPs負載于載玻片上， 利用載玻片表面掩蔽AuNPs表面部分位點， 從而可在其余位點上不對稱修飾惰性穩定基團聚乙二醇， 通過激光動態散射儀、透射/掃描電鏡、能譜儀表征了粒子表面結構。在此比色傳感體系中加入Al3+可實現AuNPs的定向和可控地聚集， 形成的寡聚體在溶液中穩定存在。此體系響應信號與Al3+在1 μmol/L～100 mmol/L內呈良好的線性關系， 線性方程為y=0.06485x + 0.60851， （R2=0.990）。此傳感體系對Al3+具有良好的選擇性， 常見金屬離子不干擾檢測， 可應用于飲用水樣品中Al3+的檢測。

關鍵詞?金納米粒子; 不對稱修飾; 定向聚集; 鋁離子; 比色檢測

1?引 言

鋁元素是地球上儲量第三的元素， 是地殼中最豐富的金屬元素[1]。適當攝入金屬元素（鈉、鉀、鎂、鋁、鋅、鐵和銅）對于機體生理代謝過程具有重要意義， 攝入過量、不平衡或缺乏均會引起機體代謝的異常[2，3]。根據WHO的報告， 日常可攝入的鋁元素為3～10 mg， 一周內機體可接受的最大量為7 mg/kg[4，5]。過量攝入鋁元素則會蓄積細胞毒性， 引發多種疾病， 如阿爾茨海默氏癥[6]、帕金森氏癥疾病[7]和肌萎縮側索硬化癥[8]等。因此， Al3+的檢測具有重要意義。目前， 檢測Al3+的方法， 如高效液相色譜-耦合質譜法、電感耦合等離子體-質譜法、原子熒光光譜法、原子吸收法、電化學法、光化學法和熒光法等[9～12]， 依靠儀器檢測存在儀器昂貴、操作復雜、耗時長、樣品前處理過程繁瑣等問題， 難以實現快速實時在線檢測[13，14]。因此， 迫切需要發展簡單、快速、低成本方法用于Al3+的檢測。

金納米粒子（AuNPs）摩爾吸光系數高， 具有表面增強拉曼散射和表面等離子體共振等光學性質[15～17]， 同時因其制備簡單、易于功能化修飾及可視化比色檢測的特性而受到廣泛關注。目前， 已有文獻報道基于檸檬酸鈉修飾AuNPs的Al3+比色檢測方法[18，19]， 其作用機理是根據路易斯酸堿理論， Al3+與檸檬酸根的供氧配體即羧酸根基團（COO）發生螯合作用， 形成穩定的復合物， 同時破壞了粒子表面的電荷平衡， 引發粒子團聚， 導致表面等離子共振發生位移， 從而產生肉眼可見的顏色變化及紫外可見吸收光譜的變化。Chen等[11]采用13 nm AuNPs檢測飲用水中Al3+， 發現在pH 2.9的條件下， 可實現較低濃度Al3+的裸眼檢測; Bothra等[13]利用吡哆醛衍生物功能化的AuNPs， 通過骨架中N及吡哆醛OH與Al3+發生絡合作用， 實現了飲用水中Al3+的檢測; Xue等[8]采用5-巰基四唑修飾的AuNPs， 利用Al3+與四唑的含氮配體發生配位作用檢測Al3+。然而， 傳統比色法檢測通常采用小粒徑AuNPs（10～20 nm）比色檢測Al3+， 未修飾的裸AuNPs靈敏度相對較低; 此外， 在已有的基于AuNPs的Al3+比色檢測體系中， 由于AuNPs易發生不規律、非定向的團聚方式， 形成大規模團聚體， 在溶液中不穩定且極易沉淀， 易受外界條件的干擾， 導致溶液顏色隨時間發生變化， 影響了定量檢測的準確性[20，21]。

已有文獻證明， 只有當檢測目標物的量多于AuNPs時， 才能實現比色檢測， 而增大粒子尺寸， 可有效降低AuNPs摩爾數量， 實現低濃度目標物的檢測[22]。然而， 增大AuNPs尺寸會嚴重影響其在溶液中的穩定性。針對這一問題， 可通過在AuNPs表面修飾水溶性良好的長鏈聚合物例如惰性穩定基團聚乙二醇（PEG）改善其穩定性。本研究制備了一種具有較大尺寸、聚乙二醇（PEG-SH）不對稱修飾的AuNPs， 建立了比色檢測Al3+的方法（圖1）。利用載玻片為基底， 將大尺寸AuNPs固定在玻片上， 少數位點被玻片所掩蔽， 大多數位點暴露在外， 利用AuS鍵將PEG修飾在AuNPs未與玻片接觸的表面， 這種不對稱修飾的優點體現在：（1）水溶性優良的惰性PEG基團可有效穩定大尺寸的AuNPs， 使其在提高靈敏度的同時在水溶液中保持穩定; （2）PEG占據粒子表面大多數區域， 限定區域的作用位點與Al3+產生螯合作用， 以定向可控的方式團聚， 形成寡聚體穩定存在于溶液中， 有效拓寬檢測的動態范圍。本研究應用PEG非對稱修飾的AuNPs， 實現了Al3+的高效、靈敏、穩定的檢測， 裸眼檢測低至1 μmol/L。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

JSM-6701F冷場發射型掃描電鏡（日本電子株式會社）; Zetasizer Nano 3600激發光動態散射儀（英國馬爾文儀器有限公司）; Lambda 35紫外-可見分光光度計（美國珀金埃爾默股份有限公司）; TF20透射電子顯微鏡（美國FEI公司）。

三水合氯金酸（HAuCl4·3H2O， Sigma-Aldrich西格瑪奧德里奇貿易有限公司）; 檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O， 北京化工工業集團有限責任公司）; 3-氨基丙基-三甲氧基硅烷（C9H23NO3Si， APTES， 阿拉丁生化科技股份有限公司， 中國上海）; 巰基聚乙二醇mPEG-SH（Mn=350， 上海炎怡生物科技有限公司）; Al（NO3）3、KCl、FeSO4·7H2O、CuCl2、Zn（NO3）2、NaCl、Pb（NO3）2、NiCl2、AgNO3等金屬鹽（天津市百世化工有限公司）; 實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

2.2?實驗方法

2.2.1?AuNPs的制備?參考文獻方法[23]合成粒徑約為13、26和38 nm AuNPs， 方法簡述如下：分別向100 mL 0.30 mmol/L的HAuCl4沸騰水溶液中加入3、2和0.75 mL 34.0 mmol/L的檸檬酸鈉溶液， 沸騰條件下劇烈攪拌反應， 顏色變成橙紅色、紫紅色直至紫色， 繼續保持沸騰15 min， 得到不同的納米金膠體溶液。冷卻至室溫， 于4℃存儲備用。利用激發光動態散射儀測定粒子尺寸， 采用紫外-可見分光光度計得到不同尺寸AuNPs的最大吸收峰， 分別為520 nm（13-nm AuNPs， 橙紅色溶液）、 526 nm（26-nm AuNPs， 紫紅色溶液）和533 nm（38-nm AuNPs， 紫色溶液）。

2.2.2?PEG不對稱修飾AuNPs（PEG-AuNPs）的制備?參照文獻[20，24]方法， 通過固態“Grafting to”策略將PEG-SH不對稱修飾在AuNPs表面的特定區域。將載玻片（約1.5 cm×2.5 cm）浸潤于Piranha溶液（H2O2-H2SO4， 7∶3， V/V）中， 在100℃下活化2 h; 浸潤在含有150 μL APTES的乙醇溶液中， 70℃下孵育30 min。清洗載玻片， 將其浸潤在檸檬酸鹽穩定的AuNPs溶液中孵育1 h， 使AuNPs負載于玻片上， 清洗玻片后， 再次浸入1 mmol/L PEG-SH（pH 8.5， 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液）中， 孵育24 h， 取出玻片， 超聲處理1 min， 即得到PEG不對稱修飾的AuNPs（PEG-AuNPs）。所制備粒子的摩爾吸光系數為7.66 × 109 L/（mol·cm）[25]， 由朗伯比爾定律計算得到AuNPs溶液濃度為0.6 nmol/L。

2.2.3?PEG-AuNPs的尺寸優化?將一系列濃度的Al3+溶液（10 μL）添加到不同尺寸的PEG-AuNPs（90 μL）溶液中， 用裸眼和紫外可見分光光度計檢測， 考察到粒徑大小對比色檢測效果的影響。

2.2.4?PEG-AuNPs比色法檢測Al3+?將一系列濃度的Al3+溶液（10 μL）加入38-nm PEG-AuNPs溶液中（90 μL）， 渦旋混勻30 s， Al3+的系列終濃度分別為0.001、0.01、0.1、1、10和100 mmol/L。用紫外-可見光譜、掃描電鏡、透射電鏡、能譜儀和裸眼觀察對結果進行表征。

2.2.5?選擇性實驗?將一系列Al3+、K+、Fe2+、Cr3+、Na+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+和Ag+標準溶液（10 μL）分別加入38 nm PEG-AuNPs溶液中（90 μL）， 終濃度均為10 μmol/L， 渦旋混勻30 s后觀察比色結果， 并利用紫外-可見分光光度計檢測。

2.2.6?水樣處理?取蘭州市自來水樣， 經0.22 μm濾膜過濾后， 采用本方法進行測定。

3?結果與討論

3.1?PEG-AuNPs的制備

基于AuNPs比色法檢測中， AuNPs的尺寸顯著影響檢測的靈敏度[26，27]。將制備的不同尺寸（13、26和38 nm）AuNPs分別與Al3+反應， 結果如圖2和圖3所示。當粒子尺寸從13 nm增大至38 nm時， 裸眼檢測Al3+的最低濃度從100 μmol/L下降至1 μmol/L， 表明AuNPs粒子尺寸越大， 靈敏度越高。這是因為只有當目標物分子量多于AuNPs數量時， 才能實現比色檢測， 在同等摩爾量的AuNPs檢測體系中， 粒子尺寸越大， 摩爾數量越少， 則可比色檢測的目標物濃度越低。然而， 在檢測中發現， 大尺寸AuNPs雖能檢測低濃度Al3+， 但易發生非定向的大規模團聚， 在溶液中迅速沉降， 導致溶液顏色消失。這種時間依賴性的顏色變化對反應條件（溫度、pH、檢測時間）要求較高， 實驗的重復性差， 嚴重影響方法的準確性和穩定性。鑒于比色法檢測靈敏度和穩定性相互矛盾的問題， 本研究選用38 nm大尺寸AuNPs以提高檢測的靈敏度， 同時在AuNPs表面特定區域修飾大的惰性穩定基團PEG， 改變粒子團聚方式， 提高大尺寸AuNPs的穩定性。

首先， 在Piranha溶液中活化載玻片， 使其表面富含羥基; 其次， 通過硅烷化反應將APTES修飾到羥基化的載玻片表面， 使玻片表面帶正電荷， 利用靜電相互作用將表面帶負電荷的檸檬酸根修飾的AuNPs固定在載玻片表面， 此時粒子表面大多數位點暴露在外， 少數位點被玻片所掩蔽。隨后， 將玻片浸入到PEG-SH溶液中， 利用AuS鍵將PEG鍵合到AuNPs表面未與載玻片接觸的位點， 得到PEG功能化的AuNPs。最后通過超聲處理， 使PEG-AuNPs從載玻片上剝離， 其被玻片掩蔽的位點暴露出來， 可與Al3+產生螯合作用， 從而使粒子發生團聚。長鏈的惰性基團PEG占據了粒子表面大多數位點， 可使粒子定向團聚， 在溶液中保持穩定， 改變常規AuNPs非定向、不規則的團聚方式。

3.2?PEG-AuNPs的表征

對合成的PEG不對稱修飾的38-nm AuNPs（PEG-AuNPs）進行表征。如圖4所示， 在載玻片表面修飾AuNPs后， 載玻片表面顏色呈紫紅色， 說明帶負電荷的大尺寸AuNPs通過靜電吸引力已成功固定在玻片上。利用激發光動態散射儀表征制得的PEG-AuNP粒徑及Zeta電位， 發現未修飾PEG的AuNPs平均電位值為42.6 mV， 而不對稱修飾PEG后， 電位值為22.3 mV， 這一明顯的位移說明粒子表面多數位點已被PEG占據， 而之前與玻片所接觸的區域依然呈現負電性， 可用于檢測Al3+。如圖5所示， 在吸收光譜圖中，檸檬酸根穩定的AuNPs在533 nm處出現了一個典型的等離子體共振峰， 修飾PEG后， PEG-AuNPs等離子體共振吸收峰紅移到540 nm， 說明粒子表面致密的PEG單分子層顯著改善了局部折射率[28，29]。AuNPs的粒徑、形狀及結構修飾直接影響了局域表面等離子體共振（LSPR）的散射半徑， 且LSPR的位移與附著在粒子表面的分子質量成正比[29，30]。利用透射電鏡進一步考察了修飾前后粒子形貌的變化（圖6插圖）， 發現PEG-AuNPs表面大部分區域有明顯的修飾層， 厚度為1～2 nm; 同時能譜表征結果也顯示， 修飾PEG后， 在粒子表面發現S元素， 這是由于AuS鍵的存在。上述表征結果均證實了PEG對AuNPs成功的非對稱修飾。這種利用玻片的固態修飾方法限定了粒子發生團聚的區域， 可改變傳統粒子大規模的團聚方式， 使寡聚體穩定存在于溶液中， 使基于納米粒子的比色檢測方法更穩定， 拓寬了線性檢測范圍。

3.3?基于PEG-AuNPs比色檢測Al3+的靈敏度

將一系列濃度梯度的Al3+加入到PEG-AuNPs溶液中， 如圖7所示， 當Al3+濃度從1 μmol/L增加到100 mmol/L時， 溶液顏色從紫色變為灰色， 發生了明顯的顏色梯度變化。在吸收光譜中， 分散的PEG-AuNPs在540 nm處具有特征峰， 加入Al3+后， 因定向聚集在730 nm處產生新的吸收峰， 隨著目標物濃度的增大， 540 nm處吸收峰強度漸減弱， 730 nm處吸收峰強度逐漸增強。這是由于PEG-AuNPs形成的寡聚體數目增多， 利用掃描電鏡可以明顯觀察到粒子以二聚體或三聚體的方式定向團聚（圖7B， 紅圈部分）[31]。同時， 吸收光譜結果顯示吸光度比值A/A0（A730/A540）與Al3+濃度在1 μmol/L～100 mmol/L范圍內呈線性關系， 檢出限（LOD， 3σ/S）為0.93 μmol/L（LOD=3σ/S）， 比傳統的未修飾功能化基團的13 nm AuNPs檢出限低兩個數量級， 極大提高了檢測靈敏度。作為對比， 在同等實驗條件下考察未修飾PEG的大尺寸AuNPs檢測Al3+時的靈敏度及其團聚方式。如圖3所示， 由于均采用大尺寸AuNPs， 二者的檢出限均約為1 μmol/L， 進一步證實了粒子尺寸對于比色檢測的靈敏度起著至關重要的作用。但常規AuNPs傳感器易發生非定向團聚， 形成大規模聚集體而發生沉降， 當目標物濃度高于100 mmol/L時， A730吸收值不再增加反而下降， 導致了顏色的快速變化及光譜吸收峰的減弱[32]。因此， PEG不對稱修飾的策略可提高AuNPs檢測靈敏度， 并提高粒子的穩定性。

3.4?基于PEG-AuNPs比色檢測Al3+的穩定性

通過比較PEG-AuNPs與常規的檸檬酸根穩定的AuNPs檢測Al3+吸收值隨時間的變化， 進一步探討了檢測Al3+的穩定性。用兩種傳感器檢測1 mmol/L Al3+標準溶液， 在相同實驗條件下監測730 nm處二者吸收值的變化， 結果如圖8所示。常規的AuNPs溶液中， 由于大規模團聚體的形成， 730 nm處吸收值在1 min內迅速上升至最大值， 隨后由于團聚體的沉降， 溶液顏色逐漸變淺， 30 min后即變為透明無色（圖8A和8B）。而PEG-AuNPs在5 min內團聚達到平衡狀態， 730 nm處吸收值達到最大值， 隨后形成的寡聚體可穩定存在于溶液中， 顏色變化在4 h內保持不變， 說明PEG定向修飾后可改變基于聚集變色的比色傳感體系的團聚方式（圖8C和8D）。兩種AuNPs顯著的差異證實了定向團聚的聚集方式可有效提高比色傳感器的長期穩定性。

3.5?方法的選擇性

選擇9種飲用水中常見的金屬離子考察PEG-AuNPs體系對Al3+的選擇性， 各金屬離子終濃度均為10 μmol/L。 如圖9所示， PEG-AuNPs對Al3+的選擇性最佳， 對Fe2+、Zn2+及Ag+也具有一定的響應， 響應值遠小于對Al3+的響應值。這是因為與其它離子相比， Al3+具有更高的有效電荷和更小的離子半徑， 因此更易于與PEG-A面羧酸根基團發生螯合作用[9]。

3.6?實際樣品分析

將PEG-AuNPs用于實際自來水樣品分析， 水樣中未檢出Al3+。以空白自來水為基質， 配制了Al3+系列濃度的樣品， 采用本方法進行檢測。如圖10所示， 吸光度比值A/A0（A730/A540）與Al3+濃度的線性方程為A/A0=0.12lg（C（μmol/L）） + 0.54（R2=0.990）， 檢出限為0.62 μmol/L（3σ/S）， 加標回收率為97.8%～108.0%， 相對標準偏差為2.9%～9.9%。WHO規定的飲用水中Al3+限量水平為7.40 μmol/L， 因此本方法可用于飲用水中Al3+的檢測[11，13，33]。 與文獻報道的利用納米粒子比色探針檢測Al3+的方法相比（表1）， 本方法的線性范圍較寬， 檢出限較低。

4?結 論

構建了一種PEG不對稱修飾的大尺寸AuNPs比色傳感器， 此固態制備方法以玻片為載體， 利用玻片的掩蔽功能， 實現基團的不對稱修飾。此功能化傳感器相比于傳統的小粒徑AuNPs傳感器， 有以下優勢：大尺寸的AuNPs能顯著提高檢測靈敏度， 裸眼檢測限比傳統小尺寸AuNPs低2個數量級; PEG占據了粒子表面大部分位點， 因此使AuNPs表面有限的位點與Al3+產生螯合作用， 粒子定向可控的聚集方式， 不僅顯著拓寬了檢測動態范圍， 而且改善了團聚體長期穩定性， 溶液顏色維持時間較長。這種新型PEG非對稱修飾的方法改變了傳統AuNPs功能化的方法， 為提高比色檢測方法的分析性能開辟了新途徑。

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