基于數字離子阱的雙向解離技術研究

徐福興 陳新 陳志揚 周鳴飛 丁傳凡

摘?要?在線形離子阱中，通過質量選擇離子的碰撞誘導解離實現串級質譜分析。在現有的實驗過程中，離子的碰撞誘導解離是通過在一對電極上加載偶極激發信號實現離子共振激發和碰撞解離，即單向離子激發。本研究基于數字離子阱技術，在線形離子阱的二對電極上加載離子激發電壓，實現離子的雙向共振激發，以提高離子的激發能量和碰撞解離效率。理論模擬計算和實驗結果表明，在不同的q值和不同的激發頻率下，雙向激發獲得更高的碰撞解離效率。此外，在q值為0.352、激發電壓為0.5 V0-p、激發頻率為107.93 kHz、解離時間為5 ms時，雙向激發解離可以獲得亮氨酸腦啡肽（m/z=556）更多的低質量數碎片離子峰，降低了離子阱質譜的低質量截止效應，顯著提高了離子阱質譜的串級質譜分析性能。

關鍵詞?離子阱質量分析器; 數字離子阱; 碰撞誘導解離; 雙向激發; 解離效率; 低質量截止值

1?引 言

質譜分析儀是目前分析測試領域中最重要的科學儀器之一，廣泛用于現代基礎科學研究、食品安全、環境保護、國防、航空航天和醫療衛生等領域，已成為現代社會發展和科技活動中不可或缺的科學工具[1～5]。

串級質譜分析是質譜技術研究分子結構最重要的方法之一[6，7]，由于四極離子阱質譜儀可在單一質量分析器中具有離子存儲、質量分析和串級質譜分析功能，使得離子阱質譜在分子分析中發揮了重要作用[8～10]。目前， 常用的串級質譜分析方法主要有碰撞誘導解離技術（Collision induced dissociation， CID）[11，12]、電子轉移解離技術（Electron transfer dissociation，ETD）[13]、電子捕獲解離技術（Electron capture dissociation，ECD）[14]和紅外光解離技術[15]等，其中，碰撞誘導解離技術實施和操作方便，是目前應用最成熟、最廣泛的解離方法[12]。在四極離子阱質譜的碰撞誘導解離過程中，通常是在離子阱中一對電極上加載離子激發交流信號AC，改變激發信號AC的幅值和頻率，當AC頻率等于某種離子的久期運動頻率時，離子將被共振激發， 并遠離離子阱束縛中心，獲得更高的動能，實現離子高速運動，然后與阱中的緩沖氣體分子發生碰撞解離[16，17]。

在CID過程中，離子通過碰撞將運動動能轉換成足夠高的內部化學鍵能，從而導致化學鍵的斷裂，產生碎片離子[18，19]。有大量的研究集中于如何獲得足夠的內能沉積到離子中，促使離子具有更高的解離效率，獲得更多的碎片信息，如脈沖q解離[20]、高振幅短時激發解離[21]和脈沖q動態CID技術[22]等。上述解離技術是在瞬間提高激發信號振幅，從而快速促使離子被激活，然后在低q值下捕獲碎片離子，獲得更低m/z離子。另外，還有其它方法增加離子內能的解離技術，如通過加熱氣體增加母體離子初始內能的熱輔助碰撞誘導解離技術[23]; 以及通過增加緩沖氣體的質量數提高離子碰撞能量[17]，改變數字方波占空比，實現直流驅動離子碰撞解離[24]。此外，本課題組前期研究中，運用多邊形電極線形離子阱技術提高質量分辨率[25]; 在碰撞解離階段，在離子阱的兩對電極上加載正弦波激發信號，驅動離子實現雙向共振激發解離，提高離子運動半徑，并獲得更高的內能[26]。上述解離技術都可有效提高離子的內部能量，使母體離子獲得更高的能量發生解離，獲取更多的碎片信息。

本研究基于數字離子阱技術，在線形離子阱的兩對電極上（x方向和y方向）分別加載離子激發信號，通過改變數字方波激發信號的頻率驅動離子共振激發，提高離子在阱內的運動動能，從而提高離子阱的串級質譜分析性能。初步模擬計算和實驗結果表明，數字方波雙向激發技術與傳統的單向激發相比，離子的運動半徑更大，因此可獲得更高的碰撞能量，離子解離效率有較大提高。研究結果表明，本方法還可以獲得更多的低質量數碎片離子信息。

2?理論模擬計算

模擬計算主要使用Axsim軟件模擬離子運動軌跡[26，27]，在軟件中使用數字方波信號加載驅動離子運動，束縛電壓幅值為200 V0-p，占空比為50%，在模擬中使用硬球碰撞模型，其碰撞條件在是0.008 Pa的壓力下，采用氦氣為緩沖碰撞氣體，溫度為300 K，選擇亮氨酸腦啡肽（m/z 556）離子用于模擬。在線形離子阱的x和y方向兩對電極上分別模擬加載雙向激發電壓信號，離子可在兩個方向上以相同的偶極激發信號同時被激發運動，優化激發頻率和幅值，使得離子在其阱內運動路徑和動能最大化，在模擬計算中，分別模擬了數字方波單向激發和雙向激發模式，其離子運動軌跡如圖1所示。通過模擬計算發現，當激發信號只加載在x方向電極時，離子在阱內僅沿著x方向運動（圖1A）; 當在x和y方向兩對電極上都加載激發信號時，離子在x和y電極的對角線方向運動（圖1B），離子運動半徑顯著增加，同時，離子的振動幅度和碰撞能量也明顯提高。

3?實驗部分

3.1?試劑

亮氨酸腦啡肽（Leu-Enk）Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu（YGGFL，m/z=556 Da）、三肽Gly-Phe-Leu（GFL，m/z=336 Da）、四肽Gly-Gly-Phe-Leu（GGFL，m/z=393 Da）、五肽Gly-Gly-Phe-Leu-Tyr（GGFLY，m/z=556 Da）、七肽Phe-Leu-Leu-Val-Pro-Leu-Gly（FLLVPLG，m/z=759 Da）均購于吉爾生化（上海）有限公司，使用甲醇-水（50∶50，V/V，其中含有0.05%醋酸）配制成1×105 mol/L的溶液。

3.2?儀器結構

質譜系統：采用自主搭建的電噴霧離子源-離子阱質譜儀系統[28，29]。儀器真空系統主要分由三級差分抽氣真空組成，由電噴霧離子源產生樣品離子，通過采樣孔、取樣錐、四極離子導引桿進入離子阱質量分析器。其中第一級差分真空選用機械泵（抽速8 L/s）抽氣，真空度可達到55 Pa。在第二級差分真空和第三級真空均使用機械泵（抽速8 L/s）和渦輪分子泵（600 L/s）組合抽氣，真空測量儀選用CPG-600（日本Tamagawa公司）測量儀器真空度，離子阱質量分析器所在的第三級真空可達到4.15×103 Pa，在離子阱質量分析器內通入氦氣作為碰撞氣體，以對離子進行碰撞冷卻和碰撞激發。通入氦氣氣體后的第三級真空度在8.6×103 Pa。

離子阱質量分析器：采用雙曲面直線形離子阱質量分析器結構，在國內生產加工，其離子阱質量分析器的x0×y0=5 mm×5 mm，電極長度為36 mm。

電路系統：采用數字方波驅動離子阱技術[30～32]，其核心是數字測控電路，采用高速DSP（Digital signal processor）芯片以及FPGA（Field Programmable Gate Array）芯片通過直接數字合成技術（Direct digital synthesizing， DDS）設計而成，輸出兩組幅度為5 V的TTL 電平信號，一組提供給方波放大電路產生數字束縛方波（Digital trapping waveform）電壓，另一組提供給輔助共振激發模塊通過分頻后得到數字激發方波（Digital excitation waveform）電壓。在碰撞解離過程中，其激發信號頻率根據不同樣品的質荷比選擇最佳頻率。輔助共振激發電壓和數字束縛電壓通過高頻變壓器與雙向模擬開關CD4066耦合后，施加到x和y方向的電極對上。通過晶體邏輯觸發器控制CD4066對激發信號的輸出，在解離階段，提供一個電壓為15 V的DC信號給模擬開關CD4066控制器，觸發CD4066，使得在x和y方向電極上都加載激發電壓，實現雙向激發信號; 在其它時序階段，無DC信號的輸出，無法觸發開關CD4066，則在y方向的電極對上沒有激發信號，其信號加載方式如圖2所示。電子倍增器（Channeltron electron multiplier）型號為CEM 4879（Burle/Photonis，美國）置于矩形離子阱x方向電極外側作為離子探測器。數字采集模塊包含模數轉換電路和前級放大電路，對電子倍增器捕捉的離子后的電流信號進行放大和模數轉換。此外，測控系統還控制著多路直流電源的輸出時序，提供離子阱上的門控電壓，控制離子的引出和存儲。

4?結果與討論

4.1?碰撞解離效率

在數字離子阱的碰撞誘導解離過程中，采用加載雙向數字方波的激發信號，通過調節方波頻率實現離子的共振激發，并與氦氣發生碰撞，實現離子解離。根據理論模擬計算情況，選用亮氨酸腦啡肽樣品（m/z 556）進行實驗測試，解離時間為20 ms，數字束縛電壓為200 V0-p，數字激發電壓為0.5 V0-p，在碰撞解離實驗中，通過改變激發頻率的方法實現離子共振激發解離[31]。碰撞解離效率（CID效率）是碎片離子的豐度總和與母體離子豐度的比值，分別比較了在不同的q值下雙向與單向激發的CID效率，結果如圖3所示。在不同的q值下，雙向激發比單向激發的解離效率都要高，當q值分別為0.352、 0.361、 0.389和0.414時，在獲得最高解離效率時所對應的激發頻率分別為108.00、111.76、117.01和121.43 kHz。當離子在同一q值下的相同數字方波激發頻率時，雙向激發頻率比單向獲得更高的離子碰撞能量，母體離子在解離時獲取更多的內能，使得母體離子在雙向激發條件下獲得的解離效率更高。

選擇三肽GFL（m/z=336 Da）、四肽GGFL（m/z=393 Da）、五肽GGFLY（m/z=556 Da）和七肽FLLVPLG（m/z=759 Da）樣品，在q=0.352時， 對雙向激發與單向激發分別進行研究，其解離效率如圖4所示。結果表明，對于不同的質荷比的樣品，在相同q值和激發頻率下的雙向激發頻率獲得的CID效率都比單向激發時高; 同時， 數字方波雙向激發技術所得到的CID效率都較高，具有廣泛的實用性。

4.2?碰撞能量轉換效率

對于串級質譜分析，除離子解離效率外，解離時所得到的碎片離子類型和豐度也同樣受到廣泛關注，而碎片離子類型和豐度主要由母體離子內部能量決定[33，34]。已有的研究工作表明，可以通過亮氨酸腦啡肽解離時的碎片離子中a4（m/z=397）、b4（m/z=425）離子強度比值研究能量轉移過程， 如驗證腦啡肽在CID過程中的能量轉移[17，35～38]。文獻研究結果表明，形成a4離子需要更多的內能[32.33，36]。因此，a4/b4離子強度比值越大，表明在母體離子解離時具有較大的內部能量，反之亦然。在CID過程中，影響母體離子內部能量的因素很多，本研究主要研究數字方波雙向激發與單向激發對母體離子的內部能量轉換，通過測量亮氨酸腦啡肽的碎片離子a4/b4比值觀察不同類型的激發技術對母體離子的內能轉移。在q=0.352，a4/b4離子強度比值隨頻率變化的結果如圖5所示。隨著頻率增加，離子強度比值逐步增加到最大值，之后緩慢降低，數字方波激發頻率在107.93 kHz時， a4/b4比值最大，且雙向激發下的a4/b4比值比單向激發高。這是由于在雙向激發技術下，離子在阱內的運動半徑更大，離子的動能也更大，使得在單位時間內分子離子間發生更多次碰撞，因此，在離子碰撞解離過程中，隨著激發頻率提高，離子獲得的共振激發能量增大，離子與中性氣體分子的碰撞頻率也不斷提高，母體離子在不斷碰撞過程中積淀了更多內能，此時得到的碎片離子a4/b4比值最大; 但當激發頻率持續升高時，電源頻率逐漸遠離離子的久期頻率，使得離子的激發能量減小，此時，離子在碰撞過程中所能達到的最大能量降低，使得反映母體離子內能的a4/b4比值反而減小。圖5清楚地顯示了這一點。

4.3?串級質譜分析

在離子阱質譜的串級質譜分析中，低質量數截止值（Low mass cutoff，LMCO）是存在的主要問題[39，40]， 解決離子阱的LMCO問題一直是離子阱質譜研究的主要內容之一。在本研究中，隔離后的亮氨酸腦啡肽母體離子通過改變激發電壓頻率方法實現碰撞解離[31]，數字束縛電壓為200 V0-p， q=0.352，激發電壓0.5 V0-p，激發頻率107.93 kHz， 解離時間為5 ms時，雙向激發比單向激發在串級質譜分析過程中獲得更多的低質量碎片離子，其譜圖如圖6所示。圖6A是傳統的單向激發技術實現的串級質譜分析譜圖，得到的碎片最低質量數m/z=323，則更低的質量數碎片離子基本上看不到。但在雙向激發技術下的串級質譜分析得到的質譜圖如圖6B所示，可以觀察到更多的低質量數碎片離子，其最小的碎片離子峰m/z 177。這是由于在雙向激發碰撞解離過程，增加離子運動行程和速度可以提高離子在碰撞過程中所獲得的總能量，有助于母離子在解離過程中獲取更大的內能。在解離過程中，母離子碎片產物在解離階段不再與共振電源信號發生共振激發時，產物離子動能在沒有完全轉移之前都可能會與碰撞氣體再次發生碰撞解離[33，34]，在碎片離子中，離子與氣體分子相互的碰撞，進一步將部分動能轉換成內能傳遞給離子，使部分碎片離子發生解離，得到更多的低質量數碎片離子。

5?結 論

本研究在基于數字方波驅動離子阱技術上，在離子阱的兩對電極上加載雙向偶極激發電壓實現碰撞誘導解離。理論模擬仿真和實驗結果都表明，本方法比傳統的單向激發方法可以提高離子在阱內的運動范圍，運動速度和動能，提高離子與緩沖氣體的碰撞能量，提高了解離效率，同時還可獲得更高的分子內能，使得實驗中檢測到更多的低質量數碎片離子峰，增加了離子阱的串級質譜分析性能，豐富了離子阱質譜在分子結構研究中的應用，可以獲取更多的分子結構信息。

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