鐵基納米粒子制備及用于pH響應雙模態磁共振成像引導下腫瘤光熱治療

劉建華 王雷 張天琪 王建秋 龔雪 崔鳳至 鄭建軍 李波 施展

摘?要?腫瘤早期診斷對于選擇合適的治療方案至關重要，而單一模態磁共振成像（MRI）難以滿足精確診斷的要求。本研究構建了聚丙烯酸（PAA）修飾的Fe3O4@MnO2納米粒子（Fe3O4@MnO2@PAA）用于pH響應的T1/T2雙模態MR成像，同時能夠介導腫瘤的光熱治療。以Fe3O4為核，可以使Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子在磁共振成像的T2信號明顯減低; MnO2納米殼在腫瘤內的酸性環境下可分解為順磁性的Mn2+，能夠增強T1信號。這種pH響應的T1/T2雙模態MRI造影劑具有良好的敏感性和特異性，可以為腫瘤診斷提供更全面、更詳實的信息。此外，Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子在近紅外區表現出優異的吸收能力，可作為一種良好的光熱轉換材料介導腫瘤的光熱治療。這種pH響應的雙模態磁共振成像介導光熱治療的新型納米診療劑，在腫瘤的MRI診斷及光熱治療方面表現出良好的應用潛能。

關鍵詞?診療劑; 磁共振成像; 雙模態成像; 近紅外光; 光熱治療

1?引 言

磁共振成像（MRI）已經廣泛應用于臨床醫療，這種影像學檢查方法對腫瘤的早期診斷及鑒別診斷具有非常明顯的優勢，對于選擇合適的治療手段至關重要。相比于其它的影像學檢查方法，如超聲（US）、X線平片（DR）、X線計算機斷層攝影（CT）及正電子發射斷層掃描（PET）等方法，MRI具有更高的圖像分辨率以及空間分辨率，同時無電離輻射污染[1]。在臨床上，為了提高MRI檢查的準確性，通常引入造影劑強化病灶部位的磁共振信號，使得病灶部位與正常部位之間的邊界更為清晰[2]。目前，最常用的MRI造影劑是釓離子螯合物，應用于T1加權成像，能夠縮短氫質子在外加磁場下的縱向弛豫率[3]。但是，這種離子型造影劑的分布明顯受到血流量影響，其信號增強的效果不僅出現在腫瘤部位，由炎癥、外傷所導致的充血水腫部位也會出現異常強化的高信號[4，5]。病灶的非特異強化使得傳統釓基造影劑難以區分某些惡性腫瘤和良性疾病。此外，FDA曾報道含釓造影劑可以在體內沉積，不僅能夠損傷中樞神經系統，還可以誘發腎源性系統纖維化，甚至造成死亡等不良后果[6]。這些潛在風險已經引起了廣泛關注，因此， 新的MRI造影劑的研制成為目前的研究熱點。

為了獲得更精確的診斷信息、構建有響應性成像能力的造影劑，腫瘤微環境的影響不容忽視。腫瘤微環境與正常組織之間差異很大，腫瘤內部組織代謝快，因此造成酸性物質堆積、乏氧狀態及H2O2富集等[7，8]。其中，針對腫瘤微環境內低pH值響應的MRI造影劑引起了研究者的廣泛關注，因為各種類型以及不同分期的腫瘤，內部都呈現酸性[9～13]。近幾年，以MnO2納米殼作為一種理想的pH響應T1加權MRI造影劑越來越受到關注，因為MnO2納米殼在腫瘤酸性環境下可以分解為順磁性的Mn2+，使得T1信號增強[14～16]。另一方面，即使MnO2納米殼在血流量豐富的非腫瘤部位聚集，也不會引起相應部位的信號異常增高，因此提高了造影劑的靈敏度和特異性。然而，單一模態的T1加權MRI并不能提供全面的診斷信息，如果融合其它的影像手段，如US、DR、CT或者PET，由于成像模式和成像機制不同，造成時間及空間誤差，丟失大量有用信息[17]。構建pH響應T1/T2成像MRI造影劑可以實現在單一設備上的雙模態成像，彌補上述不足。

本研究成功構建了聚丙烯酸（PAA）修飾的Fe3O4@MnO2殼-核結構，以Fe3O4為核心， MnO2為納米殼，形成了具有良好穩定性的Fe3O4@MnO2@PAA納米造影劑。這種新型的pH響應T1/T2雙模態MRI造影劑可以實現在腫瘤微環境中產生順磁性Mn2+，增強T1信號; 此外，Fe3O4能夠在T2加權像上更好地區分腫瘤與正常組織之間的邊界，提供更準確的信息。更重要的是，Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子在近紅外區具有優異的吸收性質，因此具備良好的光熱轉換性能。這些優良的特性使得Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子有望成為一種有良好發展前景的納米診療劑。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Bruker Vertex 70 光譜儀、D8 Foucs粉末X線衍射儀（德國布魯克公司）S-4800場發射掃描電鏡（日本日立司株式會社）; G2-F20場發射透射電鏡（美國FEI公司）; iCAP6300電感耦合等離子體-發射光譜儀（美國賽默飛世爾公司）; Aglient Gary 60紫外-可見分光光度計（美國瓦里安公司）; 808 nm激光器（中國海特光電有限公司）; 3.0 T Discovery MR750 w核磁共振儀（美國通用電氣公司）; Bruker 400 MHz超導核磁共振波譜儀（瑞士布魯克拜厄斯賓公司）; Zeta電位測試儀（英國馬爾文公司）; FLIR T420近紅外熱成像照相機（美國福祿克公司）。

FeCl3·6H2O、KMnO4、乙酸鈉（NaAc）、乙醇、乙二醇，乙二胺、聚丙烯酸（PAA）、聚烯丙胺鹽酸鹽（PAH）和2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）購于上海麥克林生化試劑公司; 細胞計數試劑盒（CCK-8試劑盒）購自大連美倫生物技術有限公司。所用試劑均為分析純。

2.2?實驗方法

2.2.1?Fe3O4納米粒子的制備?參照文獻[18]的方法構建粒徑均一的磁性Fe3O4納米粒子。首先，將40 mL乙二醇、20 mL乙二胺混合攪拌10 min，然后加入2.0 g FeCl3·6H2O和6.0 g NaAc，劇烈攪拌1 h， 將混合溶液移入100 mL的水熱反應釜，200℃反應24 h，得到Fe3O4納米粒子，用乙醇、去離子水反復洗凈，分散在去離子水中，待用。

2.2.2?Fe3O4@MnO2納米粒子的制備?參照文獻[19]的方法合成Fe3O4@MnO2納米粒子。首先，將制備的Fe3O4納米粒子（10 mmol/L， 10 mL）分散在100 mL MES緩沖溶液（0.1 mol/L， pH 6.0）中，混勻后，在超聲下加入KMnO4（10 mmol/L， 25 mL），反應40 min，將得到的棕黑色沉淀物用去離子水洗凈。

2.2.3?PAA修飾Fe3O4@MnO2納米粒子的制備?采用層層自組裝方法[20]?在Fe3O4@MnO2納米粒子表面修飾PAA。首先，將攜帶負電荷的Fe3O4@MnO2納米粒子用攜帶正電荷的聚合物PAH包裹，然后用帶負電荷的陰離子聚合物PAA再次包裹，所形成的Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子具有良好的分散性。

2.2.4?活體實驗?Balb/c小鼠（18～23 g）購自于長春億思實驗動物科技公司。在小鼠后腿前方皮下注射4T1細胞，建立腫瘤模型，待腫瘤體積達到80～110 mm3可以用于實驗測試。所有的動物操作均按照中國實驗動物條例進行，并獲得倫理審批。

2.2.5?細胞毒性評價?應用CCK-8試劑盒評價Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的細胞毒性。將人類乳腺癌細胞（MCF-7）接種于細胞培養板，在37℃，5% CO2條件下培養24 h。加入不同濃度的Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子（0～200 μg/mL， 100 μL/孔），繼續培養24 h后，加入CCK-8試劑繼續培養，測定吸光度。

2.2.6?體外及體內的磁共振檢測?Mn2+和Fe3O4納米粒子分別具有T1加權像和T2加權像的MRI效果，應用3.0 T臨床MRI掃描儀評價Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的成像效果。首先，將Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子按照不同濃度梯度分散在不同pH值的PBS緩沖溶液中，分別設置pH 5.0 和7.4兩種條件模擬腫瘤內部的酸性環境和人體的正常組織環境。Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的濃度通過ICP原子發射光譜法測定，分別為Mn2+：0～0.32 mmol/L， Fe3O4： 0～1.4 mmol/L。

體內MRI測試采用Balb/c小鼠進行，荷瘤小鼠麻醉下通過尾靜脈注入不同濃度的Fe3O4@MnO2@PAA NPs （400 μg/mL，150 μL），在不同的時間點（0、1、2、3、5、12、24、48 和 96 h）記錄小鼠腫瘤部位的T1和T2圖像。以400 μg/mL的濃度對Balb/c荷瘤小鼠進行瘤內注射，并獲得腫瘤部位注射前后的圖像。T1加權掃描的圖像參數：TR=569 ms， TE=20.7 ms， FOV=200 × 200 mm。T2加權掃描的圖像參數：TR=7279.8 ms， TE=115 ms， FOV=240 × 240 mm。

2.2.7?體內光熱成像測試?荷瘤小鼠隨機分為實驗組及對照組，實驗組采用Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子 （800 μg/mL， 0.15 mL）瘤內注射，空白對照組采用相同體積的PBS緩沖液瘤內注射。然后，對每只小鼠的腫瘤部位進行808 nm近紅外光照（1.3 W/cm2， 10 min），用紅外照相機記錄腫瘤部位的溫度變化。

2.2.8?細胞光熱治療?MCF-7細胞接種細胞培養板中，在37℃、5% CO2條件下培養24 h，保證細胞貼壁，然后加入不同濃度的Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子（0～400 μg/mL） 繼續培養3 h。用808 nm激光（1.3 W/cm2）照射每個孔10 min，用CCK-8試劑盒檢測細胞存活情況。

3?結果與討論

3.1?Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的表征

采用溶劑熱方法合成了Fe3O4納米粒子，對其進行SEM和TEM掃描，可見此納米粒子呈較均勻的球體，直徑約45 nm（圖1A）。與KMnO4反應后，在Fe3O4表面成功生成了MnO2殼，透射電鏡的檢測結果顯示殼厚度約為25 nm（圖1B）。如圖1C～1F所示，通過HAADF-STEM能譜掃描元素分布可知，納米粒子中的Fe元素均勻分布在核心區域，Mn元素位于表面，而O元素分布于整個納米粒子中，證實了Fe3O4@MnO2的殼-核結構。XRD表征結果中，位于36.8°和65.8°的峰位再次證明了MnO2殼的存在（圖2A）[21]。為了提高Fe3O4@MnO2納米粒子的分散性和生物相容性，采用攜帶不同電荷的聚合物對其進行修飾，Zeta電位測試結果見圖2B，Fe3O4@MnO2， Fe3O4@MnO2@PAH， Fe3O4@MnO2@PAA 表面的電位分別為15.5 mV、+16.3 mV和11.3 mV，證實納米粒子表面覆蓋了聚合物涂層。

Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子在近紅外區有較強的吸收（圖3A），具有作為腫瘤光熱治療介質的潛能。為了進一步探究其光熱性能，將不同濃度的Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子置于808 nm波長的激光器下進行照射（1.3 W/cm2， 10 min）。照射期間，Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子水溶液（400 μg/mL） 的溫度從23.2℃上升至54.4℃，溫度上升曲線如圖3B所示，值得注意的是，在相同的實驗條件下，去離子水的溫度變化并不明顯，說明Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子在照射過程中將光能轉換為熱能并釋放出來。這種良好的光熱轉換能力表明Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子具備腫瘤光熱治療的性能。

3.2?細胞毒性

細胞毒性是評價納米材料能否應用于生物體內的重要指標。采用CCK-8試劑盒檢測Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的毒性。將MCF-7細胞培養24 h后，加入不同濃度的Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子（6.25～200 μg/mL），繼續培養24 h后，細胞存活率均在90%以上（圖4），其結果證實Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子無明顯細胞毒性，可用于進一步的pH響應T1/T2雙模態成像及腫瘤光熱治療。

3.3?pH響應的MRI體外成像

為了評價Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子作為pH響應的T1/T2雙模態MRI造影劑的成像能力，選擇pH 7.4的納米粒子溶液模擬正常組織內環境，選擇pH 5.0的納米粒子溶液模擬腫瘤微環境，并采用3.0 T的醫用核磁共振儀進行檢測，影像結果如圖5A及5B所示。MnO2納米殼在pH 7.4和5.0的不同條件下，成像效果差異顯著，正常體內環境下的MnO2納米殼穩定性較好，沒有產生增強效果。在酸性環境下，MnO2納米殼發生解離，釋放出順磁性的Mn2+，產生明顯的T1強化信號。隨著Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子濃度增加，Fe3O4由于內在的固有磁性，并沒有受到pH值改變的影響，在兩組pH條件下都顯示了優異的T2增強效果，從另一個側面證實了Fe3O4核比較穩定，不會受到pH值的明顯影響。為了量化評估納米粒子的強化能力，應用超導磁共振波譜儀測量造影劑的弛豫值，如圖5C及5D所示，在pH 5.0的條件下，其納米殼分解為順磁性的Mn2+，縱向弛豫值（r1）為9.456 L/（mmol s），具有良好的縱向弛豫率。此外，Fe3O4納米粒子的橫向弛豫值（r2）為162.32 L/（mmol s）。以上數據表明， Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子具有優異的核磁成像效果及弛豫率。

3.4?pH響應的活體成像

進一步探究了Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子在小鼠活體內的成像效果。荷瘤小鼠麻醉后先進行T1、T2加權像MRI掃描，將圖像作為陰性對照，隨后在腫瘤部位瘤內注射Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子。如圖6A和6B所示，腫瘤部位在T1加權像的亮度明顯增加，T2加權像的亮度明顯減低，證實瘤內原位注射具有較好的T1及T2加權像效果。為了評估造影劑在體內是否具備MR雙模態成像能力，將Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子經小鼠尾靜脈注射，在不同時間點對其進行MRI掃描，結果如圖7所示，在注射后的96 h內腫瘤部位T1信號的亮度逐漸增加，T2信號的亮度逐漸變暗，與注射前陰性對照相比均發生變化。此外，如圖8所示，小鼠肝臟MRI信號在注射給藥前后也發生了變化，隨著時間推移，肝臟信號在T2加權像上逐漸變黑，表明Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子隨血液循環流經肝臟，并逐漸被肝細胞攝取。

3.5?光熱成像及治療

進一步研究Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子光熱成像及治療效果。隨機選擇兩組荷瘤小鼠，實驗組在腫瘤部位注射Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子，空白對照組注射PBS緩沖溶液。如圖9A所示，在相同條件下，經808 nm激光（1.3 W/cm2， 10 min）照射后，空白對照組溫度無明顯上升，而實驗組腫瘤部位的溫度上升20℃，達到了殺死腫瘤細胞的有效溫度。為了評估其腫瘤細胞光熱治療效果，將材料與細胞培養基混合后孵育MCF-7細胞，用808 nm激光（1.3 W/cm2， 10 min）照射所有細胞。如圖9B所示，與空白對照組相比，實驗組腫瘤細胞死亡率隨Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子的濃度增高而上升，表明此納米粒子具備腫瘤細胞的光熱治療能力。

4?結 論

成功合成了Fe3O4@MnO2@PAA的殼-核結構，此納米材料具備pH響應T1/T2雙模態MRI介導腫瘤光熱治療的功能。Fe3O4核賦予了Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的磁共振T2成像能力，MnO2納米殼具有pH調控的T1加權成像能力。同時， Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子在近紅外區的吸收能力，使其具有良好的光熱性能，能夠達到殺死腫瘤細胞的目的。這種pH響應T1/T2雙模態MRI介導光熱治療的納米診療劑有良好的發展前景，為腫瘤的診斷和治療提供了新的思路和方法。

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