尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的磷酸化應激誘導蛋白1（FoSTIP1）基因的克隆及表達分析

齊興柱 汪軍 劉磊

摘? 要? 本研究克隆了尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4， Foc4）轉錄因子FoSkn7一個候選的下游基因，結果表明該基因cDNA編碼序列全長1737 nt，編碼一個含578個氨基酸殘基的蛋白質。對其編碼的蛋白進行了結構域和進化分析，結果表明該蛋白質含有脅迫誘導蛋白（stress-in-ducible protein-1， STI1）結構域和多個三角形4肽重復序列結構域（tetratricopeptide repeat， TPR）。該蛋白質與尖孢鐮刀菌番茄專化型的磷酸化應激誘導蛋白1（STIP1）親緣關系最近，因此初步將其確定為Foc4的磷酸化應激誘導蛋白并命名為FoSTIP1。采用相對熒光定量PCR方法分析了該基因在野生型B2菌株入侵香蕉苗根部及在外源H2O2誘導情況下的表達變化，也分析了FoSKN7基因缺失突變體中該基因在外源H2O2誘導情況下的表達。結果表明在入侵香蕉苗根部及在外源H2O2誘導情況下，B2菌株中的FoSTIP1表達均有上調，而FoSKN7基因缺失突變體中FoSTIP1即使有H2O2誘導，其表達也遠低于B2菌株中的FoSTIP1。推測FoSTIP1可能是FoSkn7的靶基因并參與了Foc4抗外源氧化脅迫。

關鍵詞? 尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種;磷酸化應激誘導蛋白;表達特性

中圖分類號? S432.4? ? ? 文獻標識碼? A

當細胞面臨各種環境脅迫時，細胞內熱休克蛋白基因被激活并表達，導致熱休克蛋白大量產生。熱休克蛋白主要作為分子伴侶參與到蛋白質的折疊、轉運及組裝等過程，能恢復或加速清除細胞內已變性的蛋白質進而穩定細胞結構[1]。近年來的研究表明，分子伴侶如Hsp70和Hsp90生物功能的發揮受到各種輔助伴侶分子的調控。磷酸化應激誘導蛋白（stress-inducible protein 1， STIP1）是迄今為止研究最為廣泛的輔助伴侶分子，也被稱為熱休克蛋白70/90組織蛋白[heat shock protein （HSP） 70/90 organizing protein， HOP]，是一個62.6 ku蛋白，有9個三角形4肽重復結構域和一個核定位信號（NLS）[2]。該蛋白能夠直接與Hsp70和Hsp90相結合，并且作為連接體分子，把細胞質中的Hsp70-client蛋白復合物轉運到Hsp90上[3]。STIP1的TRR結構域在Hsp90伴侶機制中參與Hsp70和Hsp90的結合[4]。這種蛋白質復合物參與了多種細胞過程，包括轉錄、蛋白質折疊、蛋白質轉運、病毒復制、信號轉導和細胞分裂[5-6]。核定位信號序列允許STIP1在細胞周期蛋白激酶的控制下從細胞質運輸到細胞核[2]。

然而，作為一個熱休克蛋白的輔助伴侶分子，除了釀酒酵母中報道過STIP1[7]之外，目前在植物和真菌中，無論國內還是國外的文獻中都未見關于STIP1的報道。

Foc4是香蕉枯萎病的強致病性病原菌，這種病原菌對海南省乃至我國香蕉種植業造成了重大影響。本實驗室在研究Foc4抗外源氧化脅迫的轉錄組測序數據過程中獲得了一個候選的cDNA片段與已報道STIP1基因高度同源[7]，同時發現在FoSkn7轉錄因子缺失突變體中，該基因的表達大幅下調。因此，筆者將該預測基因命名為FoSTIP1，并對其進行了克隆鑒定和表達分析，為進一步開展該類蛋白作用機理研究提供基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 實驗用菌株和香蕉苗? Foc4的野生型B2菌株分離自海南省樂東縣香蕉枯萎病病株，由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所提供。FoSKN7基因缺失突變體由本實驗室制備。袋裝巴西蕉（Musa AAA， Cavendish cv. Brazil）組培苗購自海南省儋州市組培中心。

1.1.2? 試劑、引物及培養基? 植物總RNA提取試劑盒，PCR Mix反應混合物，反轉錄試劑盒[FastKing RT Kit （With gDNase）]和熒光定量PCR試劑盒[Talent qPCR PreMix （SYBR Green）]均為北京天根生化科技有限公司的產品。PCR引物（表1）由上海生工生物科技有限公司合成。真菌菌株的培養采用葡萄糖-馬鈴薯培養基（potato- glucose-agar medium， PDA; potato-glucose-dextrose broth medium， PDB）。香蕉苗采用自來水培養。

1.2? 方法

1.2.1? 菌株及香蕉苗培養方法? 為了提取H2O2處理的菌體總RNA，將Foc4野生型B2菌株及FoSKN7基因缺失突變體于PDB液體培養基中培養6 d，然后在超凈工作臺中用6層擦鏡紙過濾培養物并收集濾液（即孢子液）然后按孢子與液體PDB培養基為1∶50的比例將孢子液接種到新的PDB培養基中，28 ℃、120 r/min振蕩培養12 h，然后加入H2O2至終濃度10 μmol/mL，繼續振蕩培養5 h收集菌體，液氮研磨，提取總RNA。將袋裝香蕉組培苗轉入透明塑料杯中，自來水室溫培養10 d左右直到香蕉苗長出幼嫩的白根，再將苗轉入新的塑料杯，并加入如前所述培養12 h的B2菌株，繼續室溫放置24 h，收集菌體及香蕉苗根的混合物，液氮研磨，提取總RNA，檢測目的基因在病原菌入侵香蕉苗根部時的表達變化情況。為了檢測目的基因在FoSKN7基因缺失突變體菌株中的表達差異，突變體和B2菌株分別用H2O2（5和10 μmol/mL）處理5 h后再提取總RNA。

1.2.2? FoSTIP1基因組編碼區、啟動子和cDNA序列的克隆及生物信息學分析方法? 利用Foc4的FoSKN7基因缺失突變體菌株轉錄組信息獲得了1個表達下調明顯的熱休克蛋白基因的cDNA信息。利用該cDNA信息在NCBI網站查找同源序列的方法，獲得了一段與Foc4有較高同源性的水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi IMI 58289 ）的基因組序列（GenBank登錄號： HF679023.1），以此序列為模板設計了2對引物（表1），分別用于PCR擴增目的基因的基因組序列及其上游啟動子區的序列。利用其cDNA序列信息在其起始密碼子和終止密碼子附近設計2對引物（表1），并以10 μmol/mL H2O2誘導5 h的總RNA反轉錄的cDNA為模板，采用鑲嵌PCR方法擴增、克隆并測序Foc4的STIP1基因的cDNA序列。利用目的基因的cDNA序列預測的蛋白質序列在NCBI中進行結構域分析并查找了其他物種中與該蛋白質序列類似的蛋白。參考相關文獻[8-9]分析了啟動子序列中FoSkn7轉錄因子可能的結合位點。

所應用的生物信息學分析軟件包括：NCBI blast在線軟件http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. Cgi;NCBI結構域預測在線軟件CDD http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi。基因結構在線預測軟件softberry：http：//linux1.softberry. com/。Clustal X軟件對Foc4的STIP1蛋白序列及所獲得的同源蛋白序列進行多重序列比對，以鑒定它們之間的同源性;MEGA 10軟件對所獲得的序列構建了鄰位相接的系統發育樹，并用Bootstrap方法（Bootstrap method; model： P-distance; 1000 replicates; seed=64238）對該樹進行分析。

1.2.3? 實時熒光定量PCR分析基因表達? 按植物總RNA提取試劑盒說明書提取處理后菌株的總RNA，然后反轉錄獲得cDNA第一鏈，利用熒光定量PCR試劑盒[Talent qPCR PreMix （SYBR Green）]進行相對熒光定量PCR分析，所用引物為：5-STyg、3'-STyg，5-Actin、3-Actin（表1）。PCR反應體系按照熒光定量PCR試劑盒說明書配制。PCR反應在BIO-RAD公司的Mini OpticonTM Rreal-Time PCR System上進行。PCR熱循環條件如下：94 ℃變性30 s;退火溫度設梯度溫度48～50 ℃，并退火15 s;72 ℃延伸15 s;然后讀取熒光值，重復40個循環;最后從45～90 ℃，每隔0.2 ℃讀取溶解曲線熒光值，每讀數一次，停留2 s。運行完畢后，從Opticon Monitor 3.1軟件讀取C（t）值，以β-actin基因作為內參對照，檢測目的基因在野生型菌株入侵香蕉苗以及H2O2處理時的表達水平時，采用2ΔC（t）法計算，檢測目的基因在FoSKN7基因缺失突變體菌株中的表達水平時，采用2ΔΔC（t）法計算目的基因的相對表達水平。

2? 結果與分析

2.1? FoSTIP1基因的克隆、序列分析及蛋白質產物結構分析

在篩選Foc4抗外源氧化脅迫的功能基因的過程中獲得了一個候選基因（命名為FoSTIP1）的cDNA片段，通過輸入Genbank進行blast比對，發現與水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi IMI 58289，基因組登錄序列號：HF679023.1）高度同源。因此，以該水稻惡苗病菌同源序列為模板，設計引物擴增成功獲得了FoSTIP1的基因組編碼區序列及上游啟動子序列，其中，基因組編碼區序列的PCR擴增產物長2113 nt，上游啟動子序列PCR擴增產物長2221 nt，2個DNA片段部分重疊，測序后經序列比對分析，最終鑒定該基因組編碼區序列1902 nt， 上游啟動子序列1501 nt。經與水稻惡苗病菌基因組相應序列比對，同源性達90%，將該序列遞交到GenBank，獲得登錄序列號：MG742355。

將上述克隆及測序獲得的FoSTIP1基因組序列信息輸入到softberry基因結構預測網站，選擇了4個物種模式（Fusraium， Glarea_lozoyensis， Grosmannia_clavigera和Fusraiumgraminearum）預測轉錄序列，結果發現，以前3個物種模式為參照，預測的轉錄起始位點存在差異，但參照3個物種模式均預測到一個長1737 nt的ORF，編碼一個由578個氨基酸殘基組成的蛋白質，預測該蛋白質等電點pI=5.50，分子量為64.35127 ku，將該ORF序列與FoSTIP1（轉錄組測序編號為Gene5608）的cDNA序列進行BLAST比對，結果完全相同。利用該ORF序列，在其起始密碼子和終止密碼子附近設計引物（表1），并以10 μmol/mL H2O2誘導5 h的總RNA反轉錄的cDNA為模板，PCR擴增、克隆及測序獲得了該基因ORF的cDNA序列。經BLAST比對發現該ORF的cDNA序列與預測的cDNA序列一致，其長度為1737 nt。將該序列遞交到GenBank，獲得登錄序列號：MG742356。將以Fusraium物種模式作參考預測的轉錄序列與前面得到的上游啟動子序列及基因組編碼區序列比對，發現FoSTIP1在基因組上有4個外顯子，3個內含子（圖1）。其中，內含子1長59 nt，內含子2為53 nt，內含子3長52 nt。

FoSTIP1的結構域分析表明C末端含有一個典型的脅迫誘導蛋白（stress-in-ducible protein-1，STI1）結構域，多個三角形4肽重復序列結構域（tetratricopeptide repeat，TPR）（圖2）。

筆者搜索了NCBI的基因組數據庫，獲得了其他真菌中11個磷酸化應激誘導蛋白1的蛋白序列。將所獲得的蛋白序列與我們克隆獲得的Foc4的FoSTIP1的蛋白序列一起用MEGA7.0 軟件構建了鄰位相接樹（圖3）。進化樹分析表明，該蛋白質與尖孢鐮刀菌番茄專化型的磷酸化應激誘導蛋白1（STIP1）親緣關系最近（圖3）。

2.2? FoSTIP1在外源氧化脅迫及入侵香蕉苗根部時的表達

在前期工作中，我們分別對Foc4在H2O2 （10 μmol/mL）處理5 h及入侵香蕉苗根部24 h的B2菌株進行了轉錄組測序，數據分析發現，在未經外源H2O2處理的B2菌株樣品中，檢測到FoSTIP1轉錄本為2037，而經外源H2O2（10 μmol/mL）處理5 h的B2菌株樣品中，FoSTIP1轉錄本為5190，二者比較，log2（FC）=1.047286，表達上調。log2（FC）表示兩樣品間基因轉錄本差異倍數（Fold Change）的對數值，用于衡量表達量差異的大小，log2（FC）>0即為表達上調。在入侵香蕉苗根部24 h的B2菌株樣品中，檢測到FoSTIP1轉錄本為4197，與未經處理的B2菌株樣品中FoSTIP1轉錄本數量比較，log2（FC）=1.042924，表達上調。

為了驗證轉錄組測序數據的可靠性，采用半定量RT-PCR技術分析了上述2種條件下FoSTIP1的表達。分析以β-actin基因作為內參對照，采用2ΔC（t）法計算。結果如圖4所示，與轉錄組測序結果一致。其中，在外源H2O2（10 μmol/mL）處理5 h的B2菌株中FoSTIP1的表達量約為對照樣品中的2.201倍，入侵香蕉苗根部24 h的B2菌株中，FoSTIP1的表達量約為對照樣品中的1.878倍（圖4）。

2.3? FoSTIP1調控機理的初步分析

分析Foc4的FoSKN7基因缺失突變體菌株轉錄組測序結果發現，在FoSKN7基因缺失突變體菌株中檢測到FoSTIP1轉錄本為287，而野生型B2菌株樣品中，FoSTIP1轉錄本為2217，二者比較，log2（FC）= 2.97505，表達下調顯著。半定量RT-PCR分析結果如圖5所示，在用5 μmol/mL H2O2處理5 h的情況下，FoSKN7基因缺失突變體中FoSTIP1的相對表達量約為野生型B2菌株2/3，在用10 μmol/mL H2O2處理5 h的情況下，FoSKN7基因缺失突變體中FoSTIP1的相對表達量約為野生型B2菌株1/3。表明即使有外源氧化脅迫存在的情況下的情況下，FoSKN7基因缺失突變體中FoSTIP1的表達量相對B2菌株也大幅下調。

He等[8]報道了Skn7能結合到其靶基因（氧化脅迫應答基因）啟動子區特異結合位點（5'-GGCNNGGC-3'， 5'-GGCNGGC-3'， 5'-GGCN A A-3'， 或5'-GGCNNAGA-3'）。Morgan等[9]也報道了Skn7 能結合到其靶基因啟動子區結合位點（5'-CCG AAA-3'）。參考釀酒酵母中Skn7轉錄因子結合的堿基序列[10-11]，我們進一步分析了FoSTIP1基因上游的啟動子序列。結果發現FoSTIP1基因上游的啟動子含有2個可能的Skn7轉錄因子結合靶位點：5'-CCGAAA-3'（-1490），5'-GGCGAGA-3' （-770）（圖6）。

3? 討論

植物對病原菌入侵的最快防衛反應之一就是活性氧的急促釋放，稱為氧化爆發（oxidative burst），這種現象在植物抵抗病原菌入侵過程中具有重要作用。前期的研究工作中，我們發現Foc4在入侵位點會遭遇寄主細胞因活性氧迸發而產生的強氧化脅迫環境。因此，分別對H2O2處理過的以及香蕉苗根誘導過的Foc4野生型B2菌株，進行了轉錄組測序，以探究Foc4遭遇外源氧化脅迫時的分子應對機制。同時，還對一個Foc4的FoSKN7基因缺失突變體進行了轉錄組測序。發現FoSKN7PCR反應進行3次重復。

基因缺失突變體中一個熱休克蛋白基因（磷酸化應激誘導蛋白1，FoSTIP1）表達下調顯著。因此對該基因進行了克隆鑒定，基因結構分析，啟動子分析。并利用實時熒光定量PCR方法對其在外源氧化脅迫存在條件下及菌株入侵香蕉苗根部條件下的表達進行了分析。考慮到熱休克蛋白作為細胞內的保護性蛋白，是一類提高細胞應對外界環境脅迫能力的蛋白質。熱休克蛋白能與很多蛋白質分子結合，發揮多種生理功能：幫助氨基酸鏈折疊成正確的三維結構，清除受損而無法正確折疊的氨基酸鏈，護送蛋白分子尋找目標分子以免受到其他分子的干擾等，從而減輕各種極端環_? 標記為Skn7的可能結合靶位點，其中“ATG ”為FoSTIP1開放閱讀框的起始密碼子。

境條件如高溫、干旱、強氧化脅迫、UV線照射等對細胞的損害。所以，當細胞面臨各類環境脅迫時，第一反應就是引起多種熱休克蛋白表達上調[11]。與此相一致，本研究中FoSTIP1在外源氧化脅迫及香蕉苗根部誘導條件下的表達均大幅上調。在高等哺乳動物體內，STIP1也是一個重要的分子伴侶，其兩端分別與Hsp70和Hsp90相連，對于腫瘤細胞發生、脅迫反應和細胞增殖分化等均具有重要的調節作用。目前，STIP1作為卵巢癌發生的一種新的標志物被廣泛研究和報道[12-14]。但是在植物和真菌中，除酵母以外未見有關于STIP1功能研究的報道。

考慮到Skn7轉錄因子是一個調控多種熱休克蛋白質的轉錄因子，其蛋白質包含一個N-末端的熱休克轉錄因子DNA結合結構域（heat-shock transcription factor-like DNA-binding domain）和一個C-末端的應答調節受體結構域（response regulator receiver domain）[15]，而FoSKN7的基因缺失突變體中FoSTIP1的表達大幅下調以及FoSTIP1啟動子區存在的可能的FoSkn7結合位點表明FoSTIP1是FoSkn7可能的靶基因。

綜上所述，本研究的結果暗示FoSTIP1可能參與了Foc4抗外源氧化脅迫，原因如下：1、熒光定量PCR表明，在有H2O2誘導的情況下FoSTIP1基因表達上調。2、由于Foc4在入侵位點會遭遇寄主細胞因活性氧迸發而產生的強氧化脅迫環境，香蕉苗誘導的情況下FoSTIP1基因表達上調可能與寄主細胞中活性氧（ROS）物質的含量增加有關。3、酵母和多種絲狀真菌中的研究表明Skn7轉錄因子是參與抗外源氧化脅迫信號通路的的重要一環[10]，而轉錄組測序、熒光定量PCR及啟動子分析均證明FoSTIP1是FoSkn7的可能的靶基因。熱休克蛋白質的主要功能即為參與生物細胞應對外界環境脅迫[16]，而作為一種熱休克蛋白質，FoSTIP1也可能參與這些過程。

參考文獻

Shraddha T， Raman T， Jata S. Role of heat-shock proteins in cellular function and in the biology of fungi[J]. Biotechnology Research International， 2015， 2015（2）： 1-11.

Longshaw V M， Chapple J P， Balda M S， et al. Nuclear translocation of the Hsp70/Hsp90 organizing protein mSTI1 is regulated by cell cycle kinases[J]. Journal of Cell Science， 2004， 117（5）： 701-710.

李? 巖， 李建遠. 磷酸化應激誘導蛋白的研究進展[J]. 中外醫學研究， 2011， 9（12）： 116-118.

Odunuga O O， Longshaw V M， Blatch G L. Hop： more than an Hsp70/Hsp90 adaptor protein[J]. Bioessays， 2004， 26（10）： 1058-1068.

Johnson B D， Schumacher R J， Toft D O， et al. Hop modulates Hsp70/Hsp90 interactions in protein folding[J]. Journal of Biological Chemistry， 1998， 273（6）： 3679-3686.

Zanata S M， Lopes M H， Juliano M A， et al. Stress-inducible protein 1 is a cell surface ligand for cellular prion that triggers neuroprotection[J]. The EMBO Journal， 2002， 21（13）： 3307-3316.

Nicolet C M， and Craig E A. Isolation and characterization of STI1， a stress-inducible gene from Saccharomyces cerevisiae [J]. Molecular Cellular Biology， 1989， 9（9）： 3638-3646.

He X J， Fassler J S. Identification of novel Yap1p and Skn7p binding sites involved in the oxidative stress response of Saccharomyces cerevisiae[J]. Molecular Microbiology， 2005， 58（5）： 1454-1467.

Morgan B A， Banks G R， Toone W M， et al. The Skn7 response regulator controls gene expression in the oxidative stress response of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. The EMBO Journal， 1997， 16（5） ： 1035-1044.

Hong S Y， Ludmila V R， John E L. Oxidative stress-related transcription factors in the regulation of secondary metabolism[J]. Toxins， 2013， 5（4）： 683-702.

Raitt D C， Johnson A L， Erkine A M， et al. The Skn7 response regulator of Saccharomyces cerevisiae interacts with Hsf1 in vivo and is required for the induction of heat shock genes by oxidative stress[J]. Molecular Biology of the Cell， 2000， 11（7）： 2335-2347.

Tsai C L， Tsai C N， Lai C H， et al. Secreted stress-induced phosphoprotein 1 activates the ALK2-SMAD signaling pathways and promotes cell proliferation of ovarian cancer cells[J]. Cell Reports， 2012， 2（2）： 283-293.

Chao A， Lai C H， Wang T H， et al. Tumor stress-induced phosphoprotein1 （STIP1） as a prognostic biomarker in ovarian cancer[J]. PLoS One， 2013， 8（2）： e57084.

Lopes M H， Hajj G N， Martins V R， et al. Interaction of cellular prion and stress-inducible protein 1 promotes neuritogenesis and neuroprotection by distinct signaling pathways[J]. The Journal of Neuroscience， 2005， 25（49）： 11330-11339.

Fassler J S， West A H. Fungal Skn7 stress responses and their relationship to virulence[J]. Eukaryotic Cell， 2011， 10（2）： 156-167.

Amit K V， Danish D， Chandan S， et al. Evolutionary conservation and emerging functional diversity of the cytosolic Hsp70： J protein chaperone network of Arabidopsis thaliana[J]. G3： Genes， Genomes， Genetics， 2017， 7 （6）： 1941-1954.