芒果無機焦磷酸酶基因的克隆及其表達載體構建

白蓓蓓 荊永琳 蔡秉宇 藍麗 王佳 趙志常

摘? 要? 無機焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase，PPase）催化焦磷酸（PPi）水解為2個無機正磷酸（Pi），是蔗糖合成途徑中的調控關鍵節點之一。本研究根據已經報道的PPase基因的序列設計兼并引物，采用3′ RACE和5′ RACE方法，從貴妃芒果的果實中克隆得到了一個芒果PPase基因，將其命名為MiPPase，其全長cDNA序列為1014 bp，開放閱讀框為837 bp，編碼278個氨基酸，分子量為30.85 ku，等電點為4.68。通過系統發育分析發現該基因編碼的蛋白與紅花煙草具有較近的親緣關系。為深入探究MiPPase基因在蔗糖代謝過程中的作用，本研究成功構建出pGreenII 62-SK-MiPPase基因過量表達載體，為后續研究MiPPase基因在芒果果實蔗糖合成的作用機理提供理論依據。

關鍵詞? 芒果;PPase;基因克隆;表達載體構建

中圖分類號? S667.7; Q78? ? ? 文獻標識碼? A

無機焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase，PPase）是以焦磷酸為底物的水解酶，能夠水解多種代謝途徑中產生的焦磷酸（PPi），在自然界中廣泛存在[1-2]。PPase在植物組織中存在2種類型：一類是可溶性無機磷酸酶（soluble inorganic pyrophos-phatase，sPPase），主要存在于細胞質基質和細胞器中[3-4];第二類是膜結合焦磷酸酶（vacuolar pyrophosphatase，V-PPase），是不可溶性酶，主要與膜相結合。其中與線粒體膜相結合的PPase與可溶性無機磷酸酶結構相似，均含有24個保守氨基酸，而功能卻與沒有24個保守氨基酸的與液泡膜結合的PPase相近[5-6]。自然界中大部分PPase都是可溶性的，其主要功能就是水解PPi。PPi屬于一種高能化合物，水解釋放大量能量，可以為生物體代謝過程提供能量[7]。在植物組織器官中，PPi主要是在細胞合成RNA、糖類、蛋白質等物質的生理過程中產生的，如果不能夠及時將其清除會影響細胞的生命活動，從而對植物的正常生長發育有不良影響[8-10]。到目前為止，已經在擬南芥、馬鈴薯、煙草、橡膠樹等植物中對PPase基因有一定的研究和功能鑒定，在芒果中對于PPase作用機理方面的研究甚少。相關報道可知PPase催化焦磷酸PPi水解為2個無機正磷酸Pi，是蔗糖合成途徑中的調控關鍵節點之一。開展該研究可為后續研究MiPPase基因在芒果果實蔗糖合成的作用機理提供理論依據。本研究從貴妃芒果果實中采用3′RACE和5′RACE方法，克隆得到了一個PPase基因，通過相關生物信息學分析該基因編碼的蛋白序列理化性質、結構域及該基因的其他物種的親緣關系，并進一步構建了PPase基因的過表達載體，成功轉入農桿菌，為進一步研究PPase基因在芒果果實中的表達機制提供了依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 本實驗從貴妃芒果采集果肉作為原材料。貴妃芒果是由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所儋州芒果種質圃提供。

1.1.2? 試劑? Primer STAR MAX高保真酶、rTaq酶（TaKaRa公司）;pEASY-blunt克隆載體、大腸桿菌 DH5α感受態、RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、TransScript? -Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒、T4連接酶（北京全式金公司）;SMARTTM RACE cDNA AmplificationKit（clontech公司）;農桿菌EH105菌株由本實驗保存;引物由天一輝遠公司合成。

1.2? 方法

1.2.1? 貴妃芒果果實總RNA提取及cDNA獲取? 本實驗采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取貴妃芒果果肉總RNA，提取方法參照試劑盒說明書。cDNA獲取方法參見TransScript? -Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒操作說明書。

1.2.2? MiPPase基因全長的獲取? 采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒以貴妃芒果果實總RNA為模板合成目的基因MiPPase的第一鏈的cDNA序列，然后分別擴增MiPPase的3′端和5′端序列，連接到pMD-19T克隆載體上，轉化到DH5α大腸桿菌感受態，挑取陽性菌落送測序，根據測序結果拼接目的基因的cDNA全長，再設計含有酶切位點的特異引物（表1）擴增獲得MiPPase基因的cDNA全長序列。

1.2.3? MiPPase基因生物信息學分析? 使用NCBI上的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.html）查找MiPPase基因的開放閱讀框并推測其氨基酸序列。利用ExPASY中的ProtParam在線分析工具（http：//www.expasy.org/ tool/protparam.html）分析MiPPase蛋白序列理化性質。使用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）中的Conserved domains 在線分析MiPPase蛋白序列的保守結構域。利用DNAMAN6.0軟件預測MiPPase蛋白的結構組成及構建系統發育樹。

1.2.4? MiPPase基因表達載體的構建? 構建含目的基因的克隆載體pEASYblunt-MiPPase，提取pEASYblunt-MiPPase質粒，使用限制性內切酶Xbal I和Kpn I分別雙酶切pEASYblunt-MiPPase質粒和pGreenII 62-SK空表達載體，切膠并利用膠回收試劑盒回收所需片段。使用T4連接酶將膠回收的2個片段連接起來，轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞。利用Plasmid Mini KitⅠ試劑盒（OMEGA 公司）提取pGreenII 62-SK-MiPPase質粒，使用相同酶進行雙酶切鑒定正確后并轉入EH105農桿菌感受態細胞，菌液PCR檢測，挑取陽性菌液按體積1∶1比例加入50 %甘油，于?80 ℃保存。

2? 結果與分析

2.1? 貴妃芒果果實總RNA提取

本研究提取貴妃芒果的果實總RNA，經核酸蛋白分析儀測定其濃度和純度，OD260/280的比值在1.9～2.0之間，濃度為200～500 ng/μL，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA，結果顯示RNA完整性較好（圖1），可用于后續實驗。

2.2? 芒果PPase基因全長的獲取

根據已經報道的PPase基因的序列設計引物，利用RACE方法分別獲得MiPPase的5′端序列和3′端序列，將其拼接后獲得MiPPase的cDNA全長，重新設計含有Xbal I和Kpn I酶切位點的引物進行PCR擴增，凝膠電泳檢測獲得目的條帶約1000 bp（圖2），連接克隆載體送測序，測序

2.3? MiPPase基因生物信息學分析

2.3.1? MiPPase基因序列分析? 貴妃芒中克隆到的PPase基因全長cDNA序列為1014 bp，開放閱讀框為837 bp，編碼278個氨基酸，相對分子量為30.85 ku，預測其等電點為4.68。利用ExPASy在線軟件中的ProtParam分析MiPPase蛋白的理化性質。該蛋白不穩定系數為37.67，較穩定，疏水性GRAVY（grand average of hydropathicity）值為?0.074，說明該蛋白為親水性蛋白。根據軟件分析獲得該蛋白氨基酸組成及含量，并做柱狀圖3A。由圖3A可知構成MiPPase蛋白的氨基酸中Ile和Leu含量較高，推測可能與該蛋白的空間結構維持有關。采用Kyte & Doolittle標度，Window Size=13時計算，得到MiPPase蛋白的親疏水性信號圖（圖3B），圖中顯示峰值分布在?0.5 以下的比分布在0.5 以上的多，再次證明該蛋白為親水性蛋白。

2.3.2? MiPPase蛋白結構域分析及結構預測? 在NCBI上運用Blastp比對，發現MiPPase蛋白含有一個Put-Phosphatase（Putative Phosphatase）結構域（圖4）。運用 DNAMAN6.0在線分析軟件Prabi預測MiPPase 蛋白質的二級結構，發現 α-螺旋（Alpha helix）和無規則卷曲（Random coil）為其主要的結構原件，占據比例分別為41.01%和38.13%。

2.3.3? MiPPase蛋白親緣進化關系分析? 根據MiPPase基因編碼序列分析蛋白序列，在NCBI上利用BlastP搜索并下載該基因同源序列，利用MEGA6.0中ClustX多序列比對，鄰位相連法構建系統發育樹（圖5）。結果顯示，MiPPase蛋白與紅花煙草的PPase蛋白親緣關系較近。

2.4? MiPPase基因表達載體的構建

使用限制性內切酶Xbal I和Kpn I分別雙酶切pEASYblunt-MiPPase質粒和pGreenII 62-SK空表達載體，用T4連接酶連接雙酶切后的目的基因和空表達載體，轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞。使用相同限制酶對pGreenII 62-SK-MiPPase表達載體進行雙酶切檢測驗證（圖6A），說明該基因表達載體構建完成。將pGreenII 62-SK-MiPPase

3? 討論

無機焦磷酸酶（PPase）既是H+轉運酶[11]，也能催化焦磷酸（PPi）水解為2個無機正磷酸（Pi），是蔗糖合成途徑中關鍵的節點。可溶性的PPase可為植物細胞的生物合成反應提供能源，促進植物生長和發育。一些生物體有膜結合的PPase，這些PPase能夠為生物體提供PPi中磷酸酐鍵的能量，以此來完成跨膜的離子梯度，起質子泵的作用。除此之外，膜結合焦磷酸酶（V-PPase）還具有調節細胞質pH、保存生物能源、轉換Pi-PPi、響應逆境脅迫等作用[12-14]。有相關研究報道已從擬南芥、大麥、水稻等多種植物中克隆得到H+-PPase基因，并進行了深入研究[15-16]。與植物 H+-PPase 相比，關于 sPPase的研究進展相對緩慢，主要還集中在對分離基因、基因結構、亞細胞定位等方面的研究，對基因的表達分析及轉基因功能鑒定研究較少。

1962年Kunite[17]首次從酵母中分離純化到PPase。隨后，20世紀80年代Lahti等[18]從大腸桿菌中克隆獲得PPase的部分基因序列。Visser等[19]1998年從大麥中克隆分離到一個PPase基因，該基因在大麥根、胚乳、嫩芽等代謝器官中均有大量表達。George等[3]沉默煙草PPase基因的表達后，PPi累積量增加，伴隨著葉綠素、淀粉的含量減少，進而降低了煙草光合作用的強度。

葉片光合作用產物主要以蔗糖形式，經韌皮部運輸到果實內，經過一系列酶的催化及代謝過程，最終以果糖、蔗糖等形式存在于果實中。因此，果實品質主要由糖積累決定。果實主要在液泡中積累糖分，光合作用產物從韌皮部運輸到果實內儲存必須穿過質膜和液泡膜，而該過程是需要消耗能量的。H+-ATPase和H+-PPase分別水解ATP和PPi來為光合產物運輸提供能量[20]，轉運物質量越多，H+-ATPase越豐富，活性也越強。章英才等[21]探究得出靈武長棗果實的生長曲線為“雙S”型，呈現慢-快-慢-快-慢的生長趨勢，在2個快速生長的發育階段，質膜H+-ATPase活性均較強，糖分跨質膜運輸能力也隨之較強。李明等[22]發現蘋果PPase基因是影響蘋果酸積累的關鍵基因，且高酸果實中PPi的轉錄量變化趨勢與蘋果酸積累量變化一致。在植物的細胞質和質體中，PPi也聯系蔗糖降解、淀粉合成以及淀粉貯藏器官中糖酵解代謝的紐帶。PPi水平的高低將細胞中的合成反應和質體中的分解反應有機協調，從而在蔗糖-淀粉的轉換中起到重要的調節作用。成熟的芒果果實風味獨特，其果實的甜味主要來源果糖、蔗糖等物質。在芒果未成熟時，其果實的淀粉含量較高，隨著果實的發育，淀粉逐漸減少，蔗糖含量升高。不同芒果品種蔗糖含量有一定的差異，從而表現在品質、風味的差異。例如，象牙白品種，其果肉較淡。這些差異可以與PPase基因的表達有一定的關系。本研究從貴妃芒果果實中成功克隆獲得一個PPase基因，對其編碼的蛋白序列進行分析，并進一步構建了過表達載體，為人工調控芒果果實蔗糖含量奠定基礎，為PPase基因在芒果蔗糖代謝中的調控作用提供一定的理論依據。

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