木薯苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其對低溫脅迫的響應

吳遠航 劉秦 劉攀道 郭鵬飛 李敏 蔣凌雁

摘? 要? 本研究從全基因組水平對木薯（Manihot esculenta Crantz）苯丙氨酸解氨酶編碼基因（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）進行鑒定，并以木薯品種KU50為材料克隆了6個PAL基因，分析了低溫脅迫（7 ℃）對葉片MePAL表達模式、PAL酶活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力的影響。結果表明：低溫處理使木薯葉片迅速萎蔫卷曲，并伴隨葉片PAL酶活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力的顯著提高。Real-time PCR分析表明，在低溫處理前，MePAL1和MePAL2的相對表達量分別為0.83和1.19，顯著高于其他4個MePAL基因，低溫處理后6個MePAL基因均不同程度受低溫脅迫誘導增強表達，其中MePAL5上調最高，達50.5～142.5倍。本研究結果初步顯示低溫脅迫上調了木薯葉片MePAL的表達，促進了總酚和類黃酮的合成，提高了抗氧化損傷的能力。

關鍵詞? 木薯;低溫脅迫;苯丙氨酸解氨酶基因;類黃酮;抗氧化

中圖分類號? S533? ? ?文獻標識碼? A

木薯（Manihot esculenta Crantz）作為一種主要收獲塊根的經濟作物，是熱帶地區重要的糧食來源和生物能源原材料[1]。木薯抗旱、耐瘠薄、適應性強，在我國南方被大量種植。但木薯是典型的熱帶作物，低溫是限制其種植區域和產量的重要因素[2]。在低溫環境下，木薯細胞膜結構破壞，胞內電解質外滲，毒性物質積累，活性氧產生，葉片光合作用受阻，植株生長發育延緩，甚至死亡。

苯丙烷代謝途徑是植物緩解逆境脅迫的一條重要次生代謝途徑[3-4]。該途徑以L-苯丙氨酸或者酪氨酸為底物，通過系列酶促反應，可產生大量的苯丙烷類化合物，包括多酚、香豆素、類黃酮/花青素和大分子木質素等多種化合物[5-6]。研究表明酚類、類黃酮等物質可以作為抗氧化劑，清除逆境脅迫下產生的大量活性氧和自由基，從而降低逆境脅迫下植物所受的氧化損傷[7]。低溫逆境下，玉米可以通過調節花青素合成通路的相關基因，提高花青素的含量，增強對低溫的耐受[8]。大豆在低溫馴化過程中，多種苯丙烷代謝產物（對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、茴香酸、對香豆酸和阿魏酸）的相對含量顯著提高，這些酚酸被認為可改變細胞壁的物理特性，提高大豆對低溫的適應能力[9]。宋靜武等[10]研究了低溫脅迫下核桃（Juglans regia）葉片多酚黃酮類成分，發現這類物質的含量與低溫脅迫響應有較強的相關性。董春娟等[11]研究了黃瓜（Citrullus lanatus）幼苗的抗寒性，發現苯丙烷類次生代謝產物合成的增多可以提高細胞內抗氧化酶的活性，保持抗壞血酸（AsA）的還原性，緩解低溫脅迫以及葉片的光損傷和氧化損傷。

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase， PAL）催化L-苯丙氨酸形成肉桂酸，是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶和限速酶[12]。其活性同植物體內酚類、類黃酮等各種次生代謝產物的合成有著密切關系[13]。PAL在轉錄水平上受到多種脅迫信號的調節，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉片中的AtPAL1和AtPAL2在低溫條件下表達上調[14]。植物遭受機械傷害、干旱、高溫等逆境脅迫研究時，均可檢測到部分PAL的上調表達[15-17]。作為已完成基因組測序的重要熱帶農作物，木薯PAL信息知之甚少。本文研究了低溫脅迫下MePAL的表達模式、PAL酶活性、類黃酮含量、總酚含量和總抗氧化能力的變化，旨在解析MePAL介導的苯丙烷代謝途徑對低溫脅迫的響應模式，為木薯耐低溫品種選育和栽培提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試木薯品種為KU50（Kasetsart University 50），種莖來源于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，盆栽于海南大學熱帶農林學院實驗基地。

1.2? 材料的低溫脅迫處理

盆栽45 d后，選取健康、長勢基本一致的木薯苗，置人工氣候培養箱，在溫度25 ℃，光培養16 h，暗培養8 h的條件下“均一化”處理3天。然后降溫至7 ℃進行脅迫處理，在0、9、24 h取木薯苗的第一片和第二片完全展開的功能葉（從上往下數），每個時間點設3個生物學重復，取樣后放入液氮中速凍，貯存于80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.3? 相關生理指標的測定

1.3.1? PAL活力測定? ?測定原理：PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸和氨，反式肉桂酸在290 nm處有最大吸收值，通過測定吸光值變化計算PAL活性。具體步驟參照苯丙氨酸解氨酶（PAL）測試盒（購于南京建成生物工程研究所，貨號：A137）的說明書。

1.3.2? 類黃酮（Flavonoid）含量測定? 測定原理：在堿性亞硝酸鹽溶液中，類黃酮與鋁離子形成在502 nm處有特征吸收峰的紅色絡合物，通過測定樣品提取液在502 nm處的吸光值計算類黃酮的含量。具體步驟參照植物類黃酮檢測試劑盒（購于南京建成生物工程研究所，貨號：A142）的說明書。

1.3.3? 總酚（Total phenol）含量測定? 具體步驟參照植物總酚檢測試劑盒（購于南京建成生物工程研究所，貨號：A143）的說明書。

1.3.4? 總抗氧化能力（T-AOC）測定? 測定原理：機體中有很多抗氧化物質，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質形成穩固的絡合物，該絡合物在520 nm處特征吸收峰，通過測定520 nm處的吸光值可以計算出抗氧化能力。具體步驟參照總抗氧化能力測定試劑盒（購于南京建成生物工程研究所，貨號：A015）的說明書。

1.4? RNA提取及cDNA合成

稱取葉片樣品0.1 g，用液氮研磨成粉末，按照RNAplant Plus植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）的說明書，提取木薯總RNA，使用超微量分光光度計NanoDrop 2000檢測總RNA的濃度和純度。參照Primescript RT Reagent Kit gDNA Eraser反轉錄試劑盒（TaKaRa）的說明書合成cDNA，保存于20 ℃。

1.5? 生物信息學分析

利用木薯基因組數據庫（http：//www. phytozo

me.net/cassava）獲得木薯PAL的所有序列;利用Protparam在線工具（https：//web.expasy.org/ protp

aram/）進行蛋白理化性質分析;利用GSDS在線工具（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）進行基因結構分析;利用MEGA 7軟件建立系統進化樹。

1.6? 基因的克隆及Real-time PCR分析

利用Oligo 7軟件設計基因全長引物及定量

引物（表1），并由天一輝遠基因科技有限公司合成。利用全長引物，以上述合成的cDNA為模板，使用高保真聚合酶Phusion（Thermo）擴增MePAL的全長序列。

以木薯內參基因ef1α為參照[18]，使用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術分析基因的相對表達量。試劑盒為SYBR? Premix Ex Taq? II （Tli RNaseH Plus），購于TaKaRa公司。使用的儀器為Rotor-Gene Q（QIAGEN），采用雙標準曲線法計算相對表達量。

1.7? 數據分析

本研究的相關數據有3次生物學重復，使用 Microsoft office 2007軟件進行分析并繪制圖表，使用IBM SPSS Statistics 20軟件進行獨立樣本T檢驗來分析差異的顯著性。

2? 結果與分析

2.1? MePAL的生物信息學分析

在木薯基因組數據庫中用BLAST搜索4個擬南芥PAL的同源氨基酸序列，獲得6個木薯PAL及其候選基因（MePAL），按所在染色體上的順序對其依次命名為MePAL1-MePAL6。6個MePAL分別分布在木薯的4、7、8、9、10和16號染色體上;6個推測的PAL蛋白的等電點介于5.90～

6.31 pI之間，均為酸性蛋白;分子量介于76.97～ 78.16 ku之間（表2）。

為了比較木薯PAL之間的相似性，將推測的6個木薯PAL的氨基酸序列進行對比（圖1A）;并利用MEGA 7軟件使用Neighbor-Joining算法，bootstrap值為1000，對氨基酸序列繪制了進化樹（圖1B）;同時利用GSDS在線工具繪制了基因結構圖（圖1C）。從進化樹來看，MePAL2與MePAL5，MePAL3與MePAL4之間的同源性較高，MePAL6與其他5個MePAL同源性較低，被分在2個不同的分支;從基因結構來看，MePAL1-5都有2個外顯子和1個內含子，而MePAL6與MePAL1-5不同，只有1個外顯子，沒有內含子。

2.2? MePAL編碼基因的克隆

根據6個MePAL基因的序列，設計全長引物（表1），以cDNA為模板，進行RT-PCR反應，擴增得到6條2100 bp左右的片段，與目標大小一致，如圖2所示。

2.4? 低溫脅迫下木薯葉片PAL活性、總酚含量、類黃酮含量和總抗氧化能力變化

由圖4所示，低溫處理使木薯葉片PAL酶活性顯著增加，7 ℃處理9 h和24 h后木薯葉片PAL酶活性分別為處理前（0 h）的1.68倍和1.72倍。低溫處理還導致木薯葉片的總酚含量和類黃酮含量分別提高47.66%～55.75 %和41.97%～50.65 %，同時，總抗氧化能力也提高了1.03～2.82倍。

2.5? MePALs受低溫脅迫誘導

在低溫脅迫下的表達模式，結果表明，低溫處理9 h和24 h使MePAL3、MePAL4、MePAL5和MePAL6的表達水平顯著提高，其中，MePAL5上調倍數最多，在低溫處理9 h和24 h后的表達量分別為處理前（0 h）的142.5倍和50.5倍。此外，雖然MePAL1的表達量在低溫處理9 h后無顯著增加，但處理24 h后上調。而MePAL2僅在低溫處理9 h后顯著上調表達。

3? 討論

總酚和類黃酮是植物中重要的次生代謝物質，同植物的逆境響應有著密切的關系。Pennycooke等[19]發現低溫處理矮牽牛花（Petunia hybrida）提高了總酚含量和總抗氧化能力。此外對擬南芥的研究發現，在低溫，干旱，高鹽條件下，類黃酮合成被促進[20]。本研究中，木薯在低溫脅迫處理9 h和24 h后，葉片的總酚含量與類黃酮含量相對于0 h均顯著提高，總抗氧化能力也顯著提高，暗示總酚和類黃酮參與了木薯對低溫冷害的響應。這些物質可以作為一類供氫型自由基清除劑[21]，來降低活性氧和自由基對植物的傷害。PAL作為苯丙烷代謝途徑的第一個酶，其活性同植物體內多酚和類黃酮的總含量呈正相?關，因此PAL活性可以作為植物抗逆境能力的一個生理指標[22]。低溫處理后，木薯的PAL活性得到顯著提高，暗示PAL可能通過調節多酚和類黃酮合成，進而參與木薯對低溫脅迫的響應。

隨著大量的植物基因組序列公布，多種植物的PAL編碼基因家族已被鑒定，在所有已研究的物種上，PAL被證明是一個多拷貝基因家族。雖然這些PAL基因序列的編碼區在不同物種中差異較小，但是家族基因數量變化較大，如擬南芥中只有4個PAL基因[23]，西瓜（Citrullus lanatus）中有12個PAL基因[24]，而馬鈴薯（Solanum tuberosum）中則至少有40個PAL基因[25]。本研究從全基因組水平對木薯PAL編碼基因進行了生物信息學分析，共鑒定并克隆了6個MePAL。進化樹結果分析表明，MePAL2和MePAL5，MePAL3和MePAL4互為旁系同源基因，表明在木薯PAL基因在進化過程中經歷過基因復制事件。木薯的PAL基因多為2個外顯子，1個內含子結構，這與已報道的其它物種的PAL基因結構較為一致。但MePAL6只有一個外顯子，表明該基因在進化過程中丟失了內含子。

PAL基因的表達除了受組織特異性和發育時期的影響之外，還受不同環境條件的調控。對黃瓜的研究表明，低溫誘導了幼苗中PAL基因的表達，并顯著提高其酶活性[11]。類似地，紅葉芥（Brassica Juncea）PAL的基因表達水平和酶活性在低溫脅迫18 h后迅速升高[26]。本研究中，低溫脅迫使木薯葉片6個MePAL的轉錄水平發生不同程度的上調，同時使PAL酶活性顯著增加，表明MePAL基因轉錄水平的上調與PAL酶活性升高有關。旁系同源基因MePAL2與MePAL5，MePAL3與MePAL4在表達量高低、變化趨勢上的表現較為一致，暗示它們在受低溫脅迫時可能存在功能協同，與擬南芥、西瓜、黃瓜、葡萄（Vitis vinifera）和番茄（Lycopersicon esculentum）等的情況相似[27-28]。

綜上所述，木薯在低溫脅迫下通過上調葉片MePAL基因的表達水平和PAL酶活性，促進苯丙烷代謝途徑下游代謝產物（總酚和類黃酮）的合成，從而提高木薯葉片總抗氧化能力和低溫逆境的適應性。

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