油菜素內酯誘導小白菜初生根不對稱生長

曹璐 付影 于旭東 蔡澤坪 羅佳佳 湯竹

摘? 要? 油菜素內酯（Brassinolide，BL）能誘導單子葉植物初生根發生不對稱生長，而在雙子葉植物中還未見報道。本試驗通過外源施加不同濃度2，4-表油菜素內酯（2，4-Epibrassinolide，2，4-eBL）觀察小白菜（Brassica chinensis L.）初生根生長狀況。結果表明：2，4-eBL能誘導小白菜初生根發生不對稱生長形成卷曲。隨著2，4-eBL濃度的升高，根卷曲比例和曲率逐漸增大，同時向地性逐漸降低。試驗發現外源施加2，4-eBL可誘導雙子葉植物根不對稱生長的現象，為研究油菜素甾醇（Brassinosteroids，BRs）在根生長發育中的作用提供新途徑。

關鍵詞? 2，4-表油菜素內酯;小白菜;初生根;不對稱生長;向地性

中圖分類號? Q945.32? ? ?文獻標識碼? A

1979年Grove等[1]首次從歐洲油菜（Brassica napus L.）花粉中分離出油菜素內酯（Brassinolide， BL），至今已分離鑒定出70多種多羥基甾醇衍生物，統稱油菜素甾醇（Brassinosteroids， BRs）[2]。在所有BRs中BL的生物活性最高[3-4]。BRs在根中合成并調控根的生長發育，影響根的伸長、不定根發生、側根發育、根毛形成、根尖重力反應等[5-9]。

BRs在植物體各器官中的分布存在顯著差異，尤其在根中的含量甚微，從而導致其在根中的發現晚于下胚軸及植物體的其它部位。與此對應的是，根對BRs的反應要比植物體的其他部位敏感得多[10]。BRs最早的分離提純來自于玉米（Zea mays），隨后相繼在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、豌豆（Pisum sativum）和西紅柿（Lycopersicon esculentum）的根中被發現[11-13]。研究證明BRs在調控根端分生組織（root apical meristem，RAM）分化以及根伸長的過程中扮演著重要角色[14]。在擬南芥中，BRs在極低濃度下（≤0.1 nmol/L）促進根的伸長[10]，而在高濃度下（≥10 nmol/L）抑制[15-17]。BRs合成或信號受阻均會導致RAM變小和根長縮短[18]。BRs還在影響根的向地性上起關鍵作用，Soochul等[19]和Kim等[20]發現BRs可以增加玉米、擬南芥等不同物種主根的向地性曲率。在玉米中，當BL濃度為107 mol/L時向地性角度達到最大值;而在擬南芥中，當BL濃度為10?10～10?7 mol/L時，根向地性逐漸增強。

雙子葉和單子葉植物根存在一定區別。其中，大多雙子葉植物根為定根、根系為直根系，而單子葉植物根為不定根、根系為須根系[21]。BRs能夠誘導單子葉須根系植物水稻（Oryza sativa）幼苗初生根發生不對稱生長形成卷曲（coiling）和波浪形彎曲（wave）[22-24]。然而，關于BRs誘導雙子葉直根系植物初生根不對稱生長的研究還未見報道。本研究用2，4-表油菜素內酯（2，4- Epibrassinolide，2，4-eBL）處理雙子葉直根系植物小白菜（Brassica chinensis L.），探究2，4-eBL調控小白菜根不對稱生長、減弱初生根向地性的現象，為植物激素對根生長的研究提供新的見解。

1? 材料與方法

1.1? 材料

小白菜（Brassica chinensis L.）種子購自蔬菜物資公司，商品名稱為綠領四月慢。2，4-eBL（code E-1641）購自sigma公司，用75%乙醇溶解并配制成1 mmol/L母液。

1.2? 方法

1.2.1? 種子滅菌? 選擇飽滿且不開裂的種子，自來水浸泡30 min，在超凈工作臺上依次用75%乙醇和0.1%升汞分別浸泡30 s和7 min，無菌水浸洗5遍。

1.2.2? 初生根向地性角度的測量? 在超凈工作臺上，將滅好菌的小白菜種子接入2，4-eBL濃度梯度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L的MS固體培養基中。每只試管接種1粒種子，重復10次，并于第3天測量初生根的向地性角度。

1.2.3? 初生根主根長、曲率和卷曲比例的測量? 在超凈工作臺上，將滅好菌的小白菜種子接入2，4-eBL濃度梯度分別為0、2×10?13、2×10?12、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L的MS固體培養基中。每瓶接種10粒種子，重復6次。第8 d測量主根長、曲率和卷曲比例。

1.2.4? 培養條件? 以上均為光照和黑暗培養，光照培養條件為：溫度（25±2）℃，光強1000 lx，光周期為光照16 h/d，黑暗8 h/d;暗培養條件為：溫度（25±2）℃，黑暗24 h/d。

1.3? 數據分析

根長、曲率和向地性角度均采用Image J v1.50i軟件（https：//imagej.nih.gov/ij/index.html）測量。實驗數據的統計和分析均采用SPSS 19.0統計軟件，采用LSD檢驗和Duncan法進行數據差異顯著性多重比較。

2? 結果與分析

2.1? 外源施加2，4-eBL對小白菜初生根向地性的影響

無論是光照培養還是暗培養，2，4-eBL對小白菜初生根向地性的作用2～3 d便能表現出來。濃度大于2×10?11 mol/L時，隨著2，4-eBL濃度的升高，根尖向地性角度減小（圖1A～圖1H）。光培養下，2，4-eBL濃度為0時，根尖向地性角度為（70.9±10.4）;濃度為2×10?11 mol/L時，根尖向地性角度與對照相比有顯著差異;濃度為2×10?9 mol/L時，根尖向地性角度與對照相比有極顯著差異;濃度為2×10?7 mol/L時，根尖向地性角度是對照的38.6%，有極顯著差異（圖1I）。暗培養下，2，4-eBL濃度為0時，根尖向地性角度為（74.4±10.6）。濃度為2×10?11 mol/L及以上時，根尖向地性角度與對照相比有極顯著差異;2，4-eBL濃度為2×10?7 mol/L時，根尖向地性角度是對照的43.5%（圖1J）。可見，2，4-eBL對小白菜初生根向地性有減弱作用。

2.2? 外源施加2，4-eBL對小白菜初生根不對稱生長的影響

無論是光照培養還是暗培養，外源施加2，4-eBL能誘導小白菜初生根不對稱生長形成卷曲。光培養下，2，4-eBL濃度為0時，初生根卷曲的曲率是（0.17±0.03）mm1，卷曲比例為（3.3± 2.9）%;當濃度為2×1013 mol/L時，卷曲的比例為

A～D：光照培養3 d（A～D對應2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L）;E～H：黑暗培養3 d（E～H對應2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L）;I：光培養3 d初生根向地性角度;J：暗培養3 d初生根向地性角度;

比例尺：1 cm。*表示與對照相比存在顯著差異（p<0.05）;**表示與對照相比存在極顯著差異（p<0.01）。

（12.97±3.23）%，是對照的3.89倍，具有極顯著差異（p<0.01）。對于初生根卷曲曲率而言，當濃度小于2×10?10 mol/L時，初生根卷曲曲率隨著2，4-eBL濃度的升高緩慢上升，當濃度大于2×10?10 mol/L時，初生根卷曲曲率隨著2，4-eBL濃度的升高迅速上升。對于初生根卷曲比例而言，當濃度小于2×10?9 mol/L時，初生根卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高緩慢上升，當濃度大于2×10?9 mol/L時，初生根卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高迅速上升;當濃度為2×10?7 mol/L時卷曲的曲率和比例達到最大值，分別為（0.65± 0.06）mm1和（95±5）%，是對照的3.82和28.53倍（圖2A～圖2F、圖3C、圖3E）。暗培養下，2，4-eBL濃度為0時，初生根卷曲的曲率是（0.20±0.04）mm1，卷曲比例為（3.7±3.2）%;2，4-eBL濃度為2×10?10 mol/L時，根卷曲的曲率為（0.24± 0.04）mm1，是對照的1.2倍，差異顯著（p<0.05）;而卷曲比例為（24.57±1.87）%，是對照的6.59倍，差異極顯著;當濃度小于2×10?9 mol/L時，初生根卷曲曲率和卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高緩慢上升，當濃度大于2×10?9 mol/L時，初生根卷曲曲率和卷曲比例隨著2，4-eBL濃度的升高迅速上升;濃度為2×10?7 mol/L時卷曲的曲率和比例達到最大值，分別為（0.76±0.14）mm1和（98.23± 3.01）%，是對照的3.80和26.34倍，有極顯著差異（圖2G～圖2L、圖3D、圖3F）。

2，4-eBL對小白菜幼苗初生根長度也具有一定的影響。光培養下，2，4-eBL濃度為0時，初生根長為（55.2±17.9）mm;當濃度為2×10?7 mol/L時，初生根長為（23.63±11.39）mm，是對照的42.8%，根長明顯縮短，差異極顯著（圖3A）。暗培養下，2，4-eBL濃度為0時，初生根長為（67.1±17.7）mm;2，4-eBL濃度為2×10?13 mol/L時，初生根長為（94.26±27.82）mm，是對照的1.4倍，差異顯著;濃度為2×10?12 mol/L時，初生根長為（87.35± 15.13）mm，是對照的1.3倍，差異極顯著;濃度為2×10?8～2×10?7 mol/L時，初生根長分別為（50.47±7.57）mm和（37.86±11.68）mm，是對照的75.2%和56.4%，差異均極顯著（圖3B）。濃度相同的2，4-eBL暗培養下初生根長普遍大于光培養（圖3A、圖3B）。可見，2，4-eBL可誘導小白菜初生根發生不對稱生長以及能影響初生根的根長。

3? 討論

BRs能夠影響植物的光形態建成[25]。為了探究光照是否參與了BRs導致的根不對稱生長，本試驗通過外源添加不同濃度2，4-eBL，分別在光暗2種培養條件下，觀察小白菜初生根生長狀況。

當2，4-eBL濃度為0時，小白菜主根也會出現極少量（<4%）卷曲現象。Mullen等[26]發現重力刺激和根的接觸刺激可以使擬南芥初生根發生卷曲或彎曲現象。Jiang等[27]發現水稻根接觸到培養瓶的底部時，主根會發生卷曲，如果培養瓶中

A～F： 光照培養8 d（A～F所對應的2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L）;G～L：

黑暗培養8 d（G～L所對應的2，4-eBL濃度分別為0、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L）。比例尺：1 cm。

的介質足夠深以致主根不能接觸瓶底，主根不會發生卷曲。楊文等[23]發現接觸刺激可使2，4-eBL處理的水稻初生根發生不對稱生長的比例顯著上升。由此可見，接觸刺激對根的不對稱生長具重要作用。

BRs能使單子葉植物初生根發生不對稱生長，楊文等[22]發現2，4-eBL能夠使水稻初生根發生不對稱生長形成卷曲和波浪形彎曲，當2，4-eBL濃度為2×10?13～2×10?9 mol/L時根發生不對稱生長的比例與對照無顯著差異，當2，4-eBL濃度達到2×10?8～2×10?7 mol/L根不對稱生長比例開始增大，且均與對照相比有極顯著差異。而本文也研究了濃度分別為0、2×10?13、2×10?12、2×10?11、2×10?10、2×10?9、2×10?8、2×10?7 mol/L的2，4-eBL對小白菜初生根不對稱生長的影響，發現濃度越高，小白菜初生根不對稱生長越明顯。可見BRs不論是對單子葉植物還是雙子葉植物，都能夠誘導其根發生不對稱生長。

除BRs之外，乙烯（Ethylene， Eth）和茉莉酸（Jasmonic acid， JA）也能夠誘導植物根發生不對稱生長。Woods等[28]發現外源施加不同濃度的Eth可以誘導番茄幼苗根發生卷曲，卷曲程度取決于Eth濃度，并且添加銀離子能阻止此現象的發生。Cai等[24]發現2，4-eBL誘導水稻初生根不對稱生長的作用能被Eth抑制劑氨基氧乙酸（amino oxyacetic acid， AOA）、CoCl2和銀離子抑制，從而證明Eth可參與油菜素內酯調控的水稻初生根不對稱生長。Jiang等[27]報道自然生長的野生型水稻初生根不會發生卷曲，當外源施加0.1 μmol/L JA時，可誘導5%的初生根卷曲，0.5 μmol/L JA能誘導10%的水稻根發生卷曲。然而BRs在誘導雙子葉植物根發生不對稱生長的過程與Eth和JA是否存在聯系還有待進一步研究。

BRs還能影響初生根的向地性反應以及根長。Kim等[29]發現BRs在功能上與生長素（Auxin， IAA）結合調控植物根部向重力性。不同濃度的BL對玉米根的向地性影響不同，BL濃度范圍在10?9～10?5 mol/L時，會增強根的向地性。在濃度為10?7 mol/L時向地性角度達到最大值[19]。而本文研究了濃度為0、2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L 2，4-eBL對小白菜初生根向地性反應的影響，結果表明在這些濃度下，BRs對向地性反應有減弱作用。且2，4-eBL濃度為2×10?11、2×10?9、2×10?7 mol/L時，小白菜初生根的向地性角度逐漸減小，而不對稱生長的程度逐漸增大。根的向地性與不對稱生長之間有何種聯系還不得而知。

參考文獻

Grove M D， Spencer G F， Rohwedder W K， et al. Brassinolide， a plant growth-promoting steroid isolated from Brassica napus pollen[J]. Nature， 1979， 281（5728）： 216-217.

Oklestkova J， Rárová L， Kvasnica M， et al. Brassinosteroids： synthesis and biological activities[J]. Phytochemistry Reviews， 2015， 14（6）： 1053-1072.

Fujioka S， Yokota T. Biosynthesis and metabolism of brassinosteroids[J]. Physiologia Plantarum， 1997， 100（3）： 137- 164.

Russinova E. Plants grow on Brassinosteroids[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2011， 14（5）： 530.

徐? 曼， 齊天明， 黃立濤， 等. 油菜素內酯對高羊茅種苗萌發生長的影響[J]. 生物化工， 2017， 3（4）： 17-19.

劉? 靈， 李海航， 楊麗霞， 等. 油菜素內酯促進綠豆下胚軸不定根發生研究[J]. 科技導報， 2007， 25（5）： 56-60.

Gupta A， Singh M， Laxmi A. Interaction between glucose and brassinosteroid during the regulation of lateral root development in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2015， 168（1）： 307-320.

Wei Z， Li J. Brassinosteroids regulate root growth， Development， and Symbiosis[J]. Molecular Plant， 2016， 9（1）： 86.

Li L， Xu J， Xu Z H， et al. Brassinosteroids stimulate plant tropisms through modulation of polar auxin transport in Brassica and Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2005， 17（10）： 2738.

Müssig C， Shin G H， Altmann T. Brassinosteroids promote root growth in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2003， 133（3）： 1261-1271.

Yokota T， Sato T， Takeuchi Y， et al. Roots and shoots of tomato produce 6-deoxo-28-norcathasterone， 6-deoxo-28- nort yph asterol and 6-deoxo-28-norcastasterone， possible precursors of 28-norcastasterone[J]. Phytochemistry， 2001， 58（2）： 233-238.

Nomura T， Bishop G J， Koncz C， et al. Regulation of transcript levels of the Arabidopsis cytochrome P450 genes involved in brassinosteroid biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2002， 130（1）： 504-513.

Shimada Y， Goda H， Nakamura A， et al. Organ-specific expression of brassinosteroid-biosynthetic genes and distribution of endogenous brassinosteroids in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2003， 131（1）： 287-297.

Vragovi? K， Sela A， Friedlander-Shani L， et al. Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2015， 112（3）： 923-928.

Roddick J G， Guan M. Brassinosteroids and root development[C]//ACS Symposium Series， 1991（474）： 231-245.

Sasse J M. Recent progress in brassinosteroid research[J]. Physiologia Plantarum， 1997， 100（3）： 696-701.

Konishi H， Komatsu S. A proteomics approach to investigating promotive effects of brassinolide on lamina inclination and root growth in rice seedlings[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin， 2003， 26（4）： 401-408.

Hacham Y， Holland N， Butterfield C， et al. Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size[J]. Development， 2011， 138（5）： 839-848.

Soochul S K， Eunjoo L， Woosook C， et al. Involvement of brassinosteroids in the gravitropic response of primary root of maize[J]. Plant Physiology， 2000， 123（3）： 997-1004.

Kim T W， Lee S M， Joo S H， et al. Elongation and gravitropic responses of Arabidopsis roots are regulated by brassinolide and IAA[J]. Plant Cell & Environment， 2007， 30（6）： 679-689.

李焜章， 李學真. 雙子葉植物和單子葉植物的基本區別[J]. 生物學通報， 1988（1）： 18-19.

楊? 文， 蔡澤坪， 于旭東， 等. 生長素抑制油菜素內酯導致的水稻根不對稱生長[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（7）： 1304-1310.

楊? 文， 于旭東， 蔡澤坪， 等. 接觸刺激在水稻根不對稱生長中的作用研究[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（9）： 18-23.

Cai Z P， Yang W， Zhang H Y， et al. Ethylene participates in the brassinolide-regulated asymmetric growth of O. sativa root[J]. South African Journal of Botany， 2018（119）： 86-93.

Karnachuk R A， Golovatskaya I F， Efimova M V， et al. The effect of epibrassinolide on Arabidopsis seedling morphogenesis and hormonal balance under green light[J]. Russian Journal of Plant Physiology， 2002， 49（4）： 530-533.

Mullen J L， Turk E， Johnson K， et al. Root-growth behavior of the Arabidopsis mutant rgr1. Roles of gravitropism and circumnutation in the waving / coiling phenomenon[J]. Plant Physiology， 1998， 118（4）： 1139-1145.

Jiang J， Li J， Xu Y， et al. RNAi knockdown of Oryza sativa root meander curling gene led to altered root development and coiling which were mediated by jasmonic acid signalling in rice[J]. Plant Cell & Environment， 2007， 30（6）： 690-699.

Woods S L， Roberts J A， Taylor I B. Ethylene-induced root coiling in tomato seedlings[J]. Plant Growth Regulation， 1984， 2（3）： 217-225.

Kim S K， Chang S C， Lee E J， et al. Involvement of brassinosteroids in the gravitropic response of primary root of maize [J]. Plant Physiology， 2000， 123（3）： 997-1004.