擬南芥MYB4基因GUS載體構建及其轉基因植株的篩選

歐陽劍 吳席 徐杰娜 樊婷婷

摘要[目的]進一步驗證MYB4基因在響應干旱脅迫中的應答功能，構建ProMYB4：GUS載體，通過篩選鑒定獲得相應的轉基因植株。[方法]以野生型擬南芥植株的全基因組為模板，利用特異性引物擴增MYB4基因啟動子，將目的基因連接到pART27載體上。然后將構建成功的重組載體轉化至農桿菌GV3101，浸花法轉化野生型植株。最后通過抗性篩選和PCR鑒定獲得陽性轉基因植株。[結果] MYB4啟動子成功克隆，測序結果經過比對完全正確。抗性篩選獲得了陽性轉基因植株。[結論]成功獲得ProMYB4：GUS陽性轉基因植株，為進一步研究MYB4基因功能奠定了基礎。

關鍵詞擬南芥;MYB4基因;MYB4啟動子;轉基因植株

中圖分類號Q939.9文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0082-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.026

由于氣候變化，干旱已經成為當今世界亟待解決的重大環境問題之一[1-2]。干旱對植物的生長發育有著巨大影響，會直接導致農作物產量急劇降低，嚴重影響人類的生存質量和經濟發展[3-4]。探索抗旱相關基因的功能及其對干旱脅迫的響應機制具有重大的理論意義和實踐價值[5]。尋找提高植物抗旱關鍵性基因并利用轉基因技術對植物品種進行改良是解決上述問題的有效途徑之一[6]。研究發現MYB4基因對植物抗旱起著關鍵性作用[7-8]。筆者擬通過克隆MYB4啟動子，構建ProMYB4：GUS載體，從而進一步探究MYB4基因在擬南芥響應干旱脅迫中所起的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料。試驗采用的植物材料為擬南芥（Arabidopsis thaliana），哥倫比亞背景（Columbia，Col），購于美國擬南芥種子資源中心，后經合肥工業大學植物分子生物學實驗室繁殖所得。

1.1.2主要試劑及酶類。

Easy Taq DNA Polymerase（TransGen）;T4-DNA Ligase;PrimeSTAR HS DNA Ploymerase;限制性內切酶Kpn I （NEB）和Xho I （NEB）;無水乙醇，氯仿，蔗糖，Agar，NaCl，Yeast extract，Trypyone; DNA Loading buffer，Marker，Gold View，Silwet L-77，MES，壯觀霉素，慶大霉素，卡那霉素等。

1.1.3菌體和質粒載體。大腸桿菌感受態細胞DH5α，農桿菌感受態菌株 GV3101，pART27 載體。

1.2方法

1.2.1擬南芥全基因組DNA的提取。

剪取單棵幼苗葉片（約 100 mg）于 1.5 mL EP 管中并加入2顆直徑 3 mm 的玻璃珠，放入泡沫盒，倒入少量液氮，待液氮揮發后關蓋上下劇烈搖動至植物組織完全破碎成均勻粉末;向破碎好的植株組織中加入已預熱的 2×CTAB 緩沖液 600 μL，上下翻轉混合均勻;65 ℃水浴鍋，水浴加熱30 min，期間每隔 10 min 輕輕彈動 EP 管;取出樣品冷卻到室溫后放進塑料插板，加入配制好的酚氯仿混合試劑，上下劇烈搖晃約 15 s;室溫 13 000 r/min 離心 10 min，吸取上清至新 1.5 mL EP 管中;加入 1 mL 無水乙醇，輕輕顛倒混勻后于-20 ℃冰箱沉淀1 h;室溫 13 000 r/min 離心 10 min 后，棄上清，加入 1 mL 已配制好的 75%乙醇，室溫 13 000 r/min 離心 3 min，再次棄上清。重復此步驟再次洗滌沉淀;徹底吸除上清，開蓋倒置 EP 管室溫干燥 20 min，待乙醇徹底揮發后向管中加入 40 μL 無菌雙蒸水，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2MYB4基因啟動子擴增。

利用Primer5.0軟件設計所需引物，選用Kpn I和Xho I這2個酶切位點。上游引物FP：CGGGGTACCATAGTGAATGTGAAAAACTGAC;下游引物RP：CCGCTCGAGACTTTTATGTTTACTTTCTTTC，以獲得的全基因組為模板進行基因擴增。

1.2.3重組質粒的獲取。

將獲得的啟動子基因序列和pART27質粒采用限制性內切酶Kpn I和Xho I進行雙酶切，利用T4-DNA Ligase連接，并將連接產物轉入大腸桿菌感受態DH5α中，然后涂布于壯觀霉素LB平板上。于37 ℃培養箱過夜培養，挑選單克隆菌落進行PCR鑒定，隨后送測序。

1.2.4轉基因植株的篩選。

將測序無誤的重組質粒電擊轉化到農桿菌GV3101中，通過菌落PCR篩選鑒定陽性單克隆，挑取陽性單菌落培養，采用花序浸花法侵染野生型擬南芥植株。將所收種子干燥春化后撒于含50 μg/mL卡那霉素的1/2MS平板，置于光照培養箱培養10 d左右，挑選生長嫩綠且有根的幼苗進行移栽，后續篩選鑒定。

2結果與分析

2.1擬南芥MYB4基因啟動子的克隆

選用野生型擬南芥幼苗葉片提取全基因組DNA，以此為模板，選取MYB4基因起始密碼子ATG對MYB4啟動子進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，電泳結果顯示PCR所得片段約2 000 bp，說明MYB4啟動子擴增成功。

2.3陽性重組質粒的PCR鑒定

將酶切后的目的基因及載體質粒利用T4-DNA? Ligase 酶進行連接，16 ℃連接過夜，然后將連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，培養過夜后挑取單克隆菌落于加有相應抗性的液體培養基中振蕩培養至菌液渾濁，然后進行菌落PCR，電泳檢測結果見圖3。將陽性菌株送測序，測序結果經過比對后，顯示序列完全正確。

2.4陽性植株的篩選將測序正確重組質粒電轉至農桿菌GV3101中，用含有壯觀霉素和慶大霉素固體LB培養基篩選陽性克隆，挑選單菌落進行菌落PCR獲取陽性克隆。然后對陽性克隆進行擴增培養，采用浸花法對花期野生型擬南芥進行侵染。收取侵染后的種子，春化14 d后撒于含有50 μg/mL卡那霉素的1/2MS平板上，置于光照培養箱培養10 d左右，挑選生長嫩綠且有根的幼苗進行移栽。卡那霉素篩選結果如圖4所示。

3討論

干旱、水資源缺乏是制約我國干旱地區經濟社會發展和生態環境保護的關鍵因素[9]。據統計，我國約有1/3的土地處于干旱區，水資源缺乏制約了這些地區經濟、社會發展和生態環境建設[10-11]。探索研究抗旱相關基因的功能及其對干旱脅迫響應的機制具有重大的理論意義和實踐價值[12]。

致力于探索和研究植物抗旱關鍵性基因，并通過基因工程技術對植物品種進行優化和改良，是解決全球水資源匱乏問題的有效途徑之一[13]。前期研究表明，MYB4基因參與植物對干旱脅迫的響應，通過基因工程技術構建ProMYB4：GUS重組載體，并通過生物學手段將其轉入野生型擬南芥中，獲得轉基因植株，從而為進一步研究MYB4基因在植物中響應干旱脅迫時所起的作用奠定了基礎。

參考文獻

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