藍(lán)莓采后灰霉病病原鑒定及肉桂皮精油對(duì)其抑制作用

王丹　辛力　張靜　楊娟俠　翟浩　董成虎

摘 ? ?要：為明確山東泰安本地藍(lán)莓采后果實(shí)灰霉病及肉桂精油對(duì)其的抑菌效果，本研究從自然發(fā)病的藍(lán)莓果實(shí)上分離菌株，采用傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)、rDNA-ITS 序列分析，結(jié)合構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)進(jìn)行鑒定，并通過(guò)體外熏蒸抑菌試驗(yàn)研究肉桂精油的抑菌效果。結(jié)果表明，該病原菌為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。肉桂皮精油對(duì)灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）的最低抑菌濃度MIC及最小殺菌濃度MFC分別為0.03 μL·mL-1和0.09 μL·mL-1。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓;灰霉病;肉桂精油;體外熏蒸

中圖分類號(hào)：S663 ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.05.014

Identification of Gray Mold Rot Pathogen on Blueberry Fruit and Inhibitory Effect of Cinnamon Bark Oil

WANG Dan1， XIN Li1， ZHANG Jing1， YANG Juanxia1， ZHAI Hao1， DONG Chenghu2

（1.Shandong Institute of Pomology， Tai'an， Shandong 271000，China;2.National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products， Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products， Tianjin 300384， China）

Abstract： The study was aimed to identify gray mold rot pathogen in postharvest blueberry， in Taian， Shandong province and the antifungal effect of cinnamon oil. Based on traditional morphological identification method， rDNA-Internal transcribed spacer （ITS） analysis and phylogenetic tree， the strain was identified as Botrytis cinerea. Cinnamon bark oil exhibited obvious antifungal effect on Botrytis cinerea， and the MIC and MFC were 0.03 μL·mL-1 and 0.06 μL·mL-1， respectively.

Key words： blueberry; gray mold rot; cinnamon oil; in vitro fumigation

藍(lán)莓（Vaccinium）屬杜鵑花科、越橘屬植物，其果實(shí)富含多酚類、有機(jī)酸類、糖類、礦物質(zhì)類等營(yíng)養(yǎng)成分[1-2]，具有營(yíng)養(yǎng)保健作用，受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞。但藍(lán)莓果實(shí)含水量高，果皮較薄，采收多在高溫高濕季節(jié)，采前及貯運(yùn)過(guò)程中潛伏的微生物容易在采后適宜的條件下集中發(fā)病，最終導(dǎo)致果實(shí)腐爛變質(zhì)，喪失其商品性[3-4]。

灰霉病是藍(lán)莓果實(shí)上的主要病害，對(duì)產(chǎn)量影響較大，且全國(guó)各個(gè)藍(lán)莓產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[5]。戴啟東等[6]對(duì)藍(lán)莓灰霉病的病原菌進(jìn)行了鑒定，確定為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea），但此研究主要取自栽培期間病果和病葉，而且僅采用傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)的鑒定方法。隨著分子生物學(xué)的技術(shù)的發(fā)展，rDNA-ITS 序列分析被廣泛應(yīng)用于植物病原真菌鑒定、分類和系統(tǒng)發(fā)育研究[7-8]。

植物精油是一種植物源天然殺菌劑，在保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注。肉桂精油主要功能成份肉桂醛含量在75%以上，殺菌、抗氧化功能顯著[9]。有研究表明，肉桂精油對(duì)葡萄、番茄、芒果采后貯藏有明顯的保鮮效果[9-11]，但其在藍(lán)莓采后灰霉病控制方面的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)對(duì)山東泰安產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓采后貨架期灰霉病發(fā)病果實(shí)分離到的微生物進(jìn)行分離純化，采用傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)結(jié)合菌株ITS序列分析，對(duì)所分離到的菌株進(jìn)行鑒定，分析確定病原菌種屬。選用肉桂精油進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，為藍(lán)莓采后貨架期灰霉病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

果實(shí)：‘晚豐藍(lán)莓，2018年6月21日采自山東省泰安市良莊鎮(zhèn)藍(lán)莓合作社，當(dāng)日運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，挑選顏色大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械傷的健康果實(shí)于（25±1） ℃ 條件下放置，待自然發(fā)病后進(jìn)行病原菌的分離鑒定。

試劑：肉桂精油，購(gòu)自廣州恒信香料有限公司，濃度為85%。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（ PDA）購(gòu)自上海盛思生物科技有限公司。

儀器：ChamlGel 6000全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng) SAGE CREATION;GR110DR 全自動(dòng)高壓滅菌鍋 ZEALWAY;SPX-320生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;S1000 PCR儀 BioRad;PowerPac Basic 電泳儀 BioRad;3730XL全自動(dòng)DNA測(cè)序儀 Applied Biosystems。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離純化 采用常規(guī)組織分離法，從自然發(fā)病的藍(lán)莓果實(shí)病健處切取約2 mm組織，用75%醫(yī)用酒精表面消毒30 s，無(wú)菌水沖洗孢子接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。經(jīng)3～5次劃線分離，直至獲得純培養(yǎng)物[12]。

1.2.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察菌落培養(yǎng)性狀，包括菌落形狀、顏色，菌絲長(zhǎng)度、致密性等;挑取菌絲制片，顯微鏡觀察分生孢子的大小、形狀、顏色等特征。

1.2.3 致病性檢測(cè) 根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性檢測(cè)。取菌落邊緣直徑為5 mm的菌餅，采用針刺法將菌餅接種于已消毒果實(shí)被刺傷部位。以接種無(wú)菌的PDA培養(yǎng)基塊作為對(duì)照，在25 ℃溫度條件下培養(yǎng)7 d后觀察發(fā)病情況。每種病原菌處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15個(gè)果實(shí)。發(fā)病后于病斑處再次分離培養(yǎng)病原菌，與原接種菌株對(duì)比，形態(tài)學(xué)鑒定一致則確定為該病原菌。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定 利用CTAB提取菌株DNA，選用真菌通用引物 ITS1和ITS4對(duì)病原菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

引物序列：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC

GG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）

擴(kuò)增程序：94 ℃ 變性 5 min;94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 比對(duì)分析，搜索同源性較高的已知序列，用 DNAMAN 軟件對(duì)已知序列計(jì)算相似性;利用MEGA 5.2 軟件以 NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 肉桂精油對(duì)病原菌的體外抑菌試驗(yàn) 選擇61 mL（直徑75 mm）的培養(yǎng)皿，取一片直徑為30 mm的濾紙貼在皿蓋中央，與培養(yǎng)皿一同滅菌后使用。倒入PDA培養(yǎng)基后，用無(wú)菌打孔器取直徑7 mm的病原菌菌餅接入，分別取一定量的肉桂精油滴于濾紙片中央，使其體積含量分別為0.030，0.060，0.090 μL·mL-1，不加精油的為對(duì)照組。于25 ℃溫度條件下培養(yǎng)4～5 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑菌率。以48 h內(nèi)抑制率100%的最低精油濃度為其最低抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration， MIC），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，若仍不長(zhǎng)菌，則為最小殺菌濃度（Minimal Fungicidal Concentration， MFC）。每個(gè)濃度梯度重復(fù)4次。

抑菌率（%）=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）]× 100

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan's 多重比較進(jìn)行顯著性分析，P<0. 05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離及鑒定

在PDA培養(yǎng)基上（圖1a），菌絲初為白色絨狀，然后顏色變?yōu)闇\褐色，形成黑色菌核。分生孢子（圖1b）數(shù)根叢生，直立或稍彎曲，具隔膜，頂端呈1～2次分枝，分枝的末端膨大，上密生小梗，小梗上聚生大量分生孢子。分生孢子卵圓形、橢圓形，無(wú)色至淡褐色，單孢，（8.3～11.3） μm×（6.3～10.1） μm。

將分離純化的菌株采用穿刺法接種于藍(lán)莓健康果實(shí)，3～5 d癥狀顯現(xiàn)，7 d后發(fā)病嚴(yán)重，與原發(fā)病狀較一致，重新分離后，其培養(yǎng)性狀與原菌株相同，而對(duì)照處理不發(fā)病（圖1c）。根據(jù)柯赫氏法則，確定該病原菌為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。

將菌株ITS全序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)，與其相似序列用MEGA 5.2軟件的最大似然法（Maximum Likelihood， ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以明確病原菌分類地位。

從圖2中看出，菌株G與意大利（寄主不詳）灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）（KT587323.1）、美國(guó)（寄主不詳）富氏葡萄孢盤(pán)菌（Botryotinia fuckeliana）（AY544695.1）、愛(ài)沙尼亞的寄生樺木的蠟盤(pán)菌（Rutstroemia firma）（KX138402.1）聚在同一枝。結(jié)合孢子形態(tài)特征，將分離自藍(lán)莓灰霉發(fā)病部位菌株鑒定為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。

2.2 肉桂精油對(duì)Botrytis cinerea的體外抑菌效果

以體外熏蒸的抑菌試驗(yàn)觀察不同濃度肉桂精油對(duì)灰葡萄孢霉菌絲生長(zhǎng)延伸量的抑制作用，如圖3所示，0.03 ～0.09 μL·mL-1濃度范圍內(nèi)，隨濃度增大，抑菌活性增強(qiáng)。0.06 μL·mL-1和0.09 μL·mL-1這2個(gè)濃度在培養(yǎng)72 h內(nèi)，均未見(jiàn)菌絲生長(zhǎng)和蔓延，抑菌率為100%。在濃度0.09 μL·mL-1時(shí)，144 h內(nèi)抑菌率均達(dá)100%，0.06 μL·mL-1濃度下，144 h 內(nèi)抑菌率基本在80%以上，而在0.03 μL·mL-1濃度下，72 h內(nèi)抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，培養(yǎng)120 h后，抑菌率即降至52.12%，120 h后，基本沒(méi)有抑制效果。肉桂皮精油對(duì)灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）的最低抑菌濃度MIC及最小殺菌濃度MFC分別為0.03 μL·mL-1和0.06 μL·mL-1。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、rDNA-ITS序列分析及回接試驗(yàn)證實(shí)，山東泰安產(chǎn)區(qū)‘晚豐藍(lán)莓采后果實(shí)灰霉病是由灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）引起。肉桂精油對(duì)灰葡萄孢霉體外熏蒸抑菌效果顯著，最低抑菌濃度MIC及最小殺菌濃度MFC分別為0.03 μL·mL-1和0.09 μL·mL-1。陳倩茹等[13]通過(guò)觸殺方式測(cè)定了香茅精油對(duì)灰葡萄孢完全抑制效果的濃度為1.5 μL·mL-1，與本試驗(yàn)肉桂皮精油的有效濃度相差10倍以上，筆者分析這與精油的類型有一定關(guān)系，但最主要原因還是作用方式的不同，觸殺用量要遠(yuǎn)高于熏蒸處理。這與施俊鳳等[14]研究較為一致，其結(jié)果為百里香精油通過(guò)熏蒸和直接接觸作用對(duì)番茄灰霉病的抑制濃度分別為0.1 μL·mL-1和1.6 μL·mL-1，但精油具體的抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

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