骨橋蛋白和Ezrin蛋白在原發性肝癌組織中的表達及其與臨床特征和預后的相關性

張洪川 張玉璽 段叢迪

原發性肝癌是我國常見惡性腫瘤之一[1]。骨橋蛋白是一種帶負電的非膠原性骨基質糖蛋白，廣泛的分布于多種組織和細胞中[2-3]。骨橋蛋白被認為與腫瘤的發生具有一定的相關性[4]。Ezrin蛋白是細胞骨架與細胞膜之間的連接蛋白,參與了微絨毛的形成并與細胞形態的維持、運動、黏附及生存有關[5]。近年來骨橋蛋白和Ezrin蛋白在早期細胞免疫應答、肉芽腫炎癥、腫瘤發生與轉移的作用中倍受關注[6]。本研究探討骨橋蛋白和Ezrin蛋白在原發性肝癌組織中的表達及其與臨床特征和預后的相關性，旨在為原發性肝癌患者的治療提供理論依據。

資料與方法

一、一般資料

將2013年1月至2016年12月于濮陽市油田總醫院治療的原發性肝癌手術切除標本46例作為研究對象(A組)，同時選取不典型增生肝組織標本46例(B組)以及正常肝組織標本46例(C組)。共選取138例存檔石蠟包埋標本，年齡在27～76歲，平均年齡為(45.21±9.34)歲。納入標準：所有患者均經手術切除治療，術后病理學確診為肝癌，患者臨床資料齊全，具有術后隨訪資料；本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)存在原發性腎功能障礙者；(2)存在其他系統組織器官惡性腫瘤者；(3)患者術前接受過放化療治療等。

二、研究方法

(一)免疫組化試劑 濃縮型屬鼠抗人骨橋蛋白單克隆抗體購自美國Santa Cruz生物科技公司；鼠抗人Ezrin基因蛋白單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發有限公司；免疫試劑盒購自基因科技有限公司。所有操作方式均按照試劑盒說明執行。

(二)免疫組化SP法 按照1∶100稀釋骨橋蛋白和Ezrin蛋白抗體，DAB顯色，蘇木素復染。一抗用PBS緩沖液代替作為空白對照。棕黃色信號表示陽性，定位于細胞與胞質中。

(三)原位雜交步驟 先在無RNA酶的環境中進行操作，用二甲苯組織切片進行脫蠟處理，再經過梯度乙醇水化，在37℃下蛋白酶消化30 min，在無水乙醇中脫水10 s，分別滴一滴探針溶液于各切片上，蓋上蓋玻片，保持37℃室溫不變過夜。

(四) TBS浸泡步驟 先打開蓋玻片，TBS洗片3次3 min。同時于37℃下滴2～3滴高辛抗體等待30 min。TBS浸泡3 min。DAB顯色，蘇木素復染。如果出現棕黃色顆粒信號表示雜交陽性，定位于細胞質，以TBS緩沖液代替探針作陰性對照，原發性肝癌中骨橋蛋白與Ezrin蛋白陽性于細胞核內表達，DAB顯色，呈棕黃色顆粒，肝癌組織中蛋白質免疫組化染色位于細胞膜與細胞質內，呈棕黃色。參照染色強度和陽性表達細胞數來確定判定結果。

三、術后隨訪

隨訪方式采用電話、上門、門診或住院等方式進行，記錄肝癌患者術后復發、轉移以及死亡情況。

四、統計方法

結 果

一、骨橋蛋白在三組標本中的表達情況比較

A組患者骨橋蛋白陽性率為76.09%(35例)、Ezrin蛋白陽性表達率為73.91%(34例)明顯高于B組的39.13%(18例)、50.00%(23例)與C組的19.57%(9例)、21.74%(10例)(P<0.05)，B組患者骨橋蛋白和Ezrin蛋白陽性表達率高于C組(P<0.05)。

二、骨橋蛋白和Ezrin蛋白在肝癌組織中的表達與臨床病理特征的關系

骨橋蛋白和Ezrin蛋白表達水平與患者性別、年齡、HBsAg的陽性表達、有無肝硬化、腫瘤大小、腫瘤分化程度、AFP水平、腫瘤數目、TNM分期等臨床病理特征無明顯相關性(P>0.05)，而在發生轉移與癌組織累及肝被膜患者中骨橋蛋白的陽性表達率明顯高于未發生轉移與未累及肝被膜患者(P<0.05)，且腫瘤越大 Ezrin蛋白在癌組織中的陽性表達率越高(P<0.05)。見表1。

表1 骨橋蛋白與臨床特征的關系(例，%)

注：與無轉移比較，aP<0.05，與未累及肝被膜比較，bP<0.05，與腫瘤≤5 cm比較，cP<0.05

三、骨橋蛋白與患者預后狀況相關性分析

骨橋蛋白在陽性患者中位生存時間為32.10個月，陰性患者平均生存時間為37.10個月，差異具有統計學意義(P<0.05)。

四、Ezrin蛋白與患者預后狀況相關性分析

Ezrin蛋白在陽性患者中位生存時間為30.10個月，陰性患者平均生存時間為38.10個月，差異具有統計學意義(P<0.05)。

討 論

骨橋蛋白是目前臨床上新提出的一種監測肝癌轉移與復發的指標[7]。白治苗等[8-9]研究了骨橋蛋白在子宮內膜異位中的表達情況，結果證實骨橋蛋白在子宮內膜異位癥中具有較高表達水平，并且是誘導子宮內膜異位癥發生的關鍵，為子宮內膜異位癥的治療提供了一種新的治療思路。胡雪等[10]研究證實，骨橋蛋白也參與胃癌的發病，可較好預測胃癌的生長/浸潤以及轉移過程所發生的基因以及分子變化。本研究結果顯示，骨橋蛋白在肝癌組織中的陽性表達率明顯高于正常組織與不典型增生患者，提示骨橋蛋白在肝癌的預測中具有一定作用，并且參與肝癌的轉移，這與以上研究結果相似。且骨橋蛋白陽性表達率越高越影響肝癌患者的預后，這與李穎利[11]、李欣遙等[12]學者的研究結果相似。本研究結果證實，肝癌患者可通過檢測骨橋蛋白的表達情況來判斷腫瘤轉移、復發以及預后情況。

Ezrin蛋白是一種細胞骨架連接蛋白，其對調節細胞活動，如生存、黏附、遷移等具有重要作用[13]。本研究結果顯示，Ezrin蛋白在肝癌組織中表達率明顯上升，并且在術后的隨訪中發現，患者的生存時間與Ezrin蛋白的表達情況有密切相關性，這與黃濤等[16]研究結果一致。證實了Ezrin蛋白在肝癌的發生、發展具有重要意義，對肝癌的治療起到一定的指導意義。