肝細胞癌miR-449a表達及臨床意義

顏婧 周源 潘德鍵

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)居全球范圍內最常見的惡性腫瘤的第五位，也是第三大與死亡相關的腫瘤[1-2]。McroRNAs與多種人類疾病特別是癌癥有關[3]。既往一項研究表明，miR-449a可抑制pRb-E2F11活性并誘導細胞周期G1期停滯[4]。盡管以前研究揭示了miR-449a的部分功能，但其對HCC預后影響的研究仍有限。在本研究，我們應用實時熒光定量聚合酶鏈反應 (real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測HCC患者miR-449a水平，并探索miR-449a對HCC預后的影響。

資料與方法

一、研究對象

收集我院2012年1月至2013年10月接受手術切除治療的HCC患者289例，術中獲取患者癌組織標本并迅速放置-80℃冰箱保存。記錄相關的臨床病理特征和人口學特征。

納入標準：(1)病理證實為HCC；(2)接受根治性切除術治療；(3)無其他惡性疾病；(4)患者和家屬對研究內容知情，且簽署知情同意書。

排除標準：(1)不符合手術適應證；(2) 患有惡性腫瘤病史或術前檢查發現合并其他惡性腫瘤；(3) 術后復發再次手術的患者；(4) 合并精神類疾病。本研究經我院倫理委員會批準。

二、miR-449a的檢測

使用TRIzol提取總RNA。用cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。采用RNAiso試劑盒提取microRNA。使用one Step PrimeScript○RmiRNA cDNA對microRNA進行多核-晚期和逆轉錄。隨后，使用ABI 7500系統進行反應。內部控制是18S和U6 microRNA。應用qRT-PCR以及2-△CT法檢測miR-449a表達量。反應在相似條件下重復三次。引物如下：U6 (HmiRQP9001, GeneCopoeia, Inc.), hsa-miR-449a (HmiRQP0504, GeneCopoeia, Inc.), c-Met (forward 5’ -TGC ACA GTT GGT CCT GCC ATG A-3’ and reverse 5’ -CAG CCA TAG GAC CGT ATT TCG G-3’), and 18S RNA (forward 5’ -CTC TTA GCT GAG TGT CCC GC-3’ and reverse 5’-CTG ATC GTC TTC GAA CCT CC-3’).

三、隨訪

根據我院自制的隨訪登記表進行隨訪，隨訪內容包括出院后的治療、用藥、睡眠、飲食、和患者的生存狀況，每次隨訪均需填寫隨訪表。方式：采用門診隨訪、電話隨訪、以及上門隨訪相結合的方式進行隨訪。隨訪時間間隔：首次隨訪時間為患者出院后3個月，出院后3個月到1年每隔3個月隨訪1次，出院后2～4年每隔6個月隨訪1次，出院后4～5年每年隨訪1次。生存時間：隨訪的起始時間為患者的手術時間，終點時間為死亡時間(如果未觀察到死亡則為終止觀察時間)，生存時間定義為終點時間與起始時間之差。

四、統計學方法

使用SPSS版本21.0進行數據分析(Chicago, IL, USA)。計數資料之間的差異用χ2檢驗來評價。計量資料間的差異用獨立樣本t檢驗來評價。miR-449a對HCC預后的預測價值采用受試者工作曲線(receiver operating characteristic，ROC)來估計。用Kaplan-Meier 并Log-rank檢驗進行生存分析，尋找影響HCC預后的潛在危險因素。單因素分析有意義結果納入Cox多因素分析影響HCC預后的獨立危險因素。P<0.05被認為具有統計學意義。

結 果

一、研究對象一般資料

納入的289例患者中，男性231例，女性58例。平均年齡為(53.1±10.3)歲(范圍：32～74歲)。Chid-Pugh分級顯示，肝功能處于A級者258例，B級者31例。感染肝炎病毒者256例。miR-449a表達水平為1.84±0.78。截至2018年10月，289例HCC患者中，失訪21例，隨訪率92.7%。在隨訪到的268例患者中，死亡146例。結果見表1。

表1 研究對象一般資料

二、MiR-449a對HCC患者預后的預測價值

miR-449a對HCC預后的預測價值見圖1，miR-449a預測HCC死亡的最佳臨界點為1.2。當miR-449a為1.2時， miR-449a預測HCC死亡的靈敏度為63.0%，特異度為60.7%；AUC曲線下面積為0.63。

圖1 miR-449a預測HCC死亡的受試者工作特征曲線

三、單因素生存分析

Kaplan-Meier并Log-rank分析顯示，Child-Pugh B級[HR(95%CI): 1.13(1.08～1.17)]、較高ALT水平[HR(95%CI): 1.63(1.28～2.12)]、AST[HR(95%CI): 1.78(1.33～2.31)]、ALP[HR(95%CI): 1.38(1.05～1.84)]、AFP[HR(95%CI): 2.12(1.95～2.32)]、較大腫瘤[HR(95%CI): 1.16(1.08～1.21)]、較低ALB[HR(95%CI): 1.42(1.37～1.52)]、miR-449a表達[HR(95%CI): 2.21(1.78～2.37)]可增加HCC患者死亡風險。結果見表2及圖2。

四、多因素Cox回歸分析

將Kaplan-Meier并Log-rank分析結果顯示差異有統計學意義的變量納入Cox回歸模型進行分析得出： Child-Pugh B級[HR(95%CI)：1.11(1.07～1.15)]、較高ALT水平[HR(95%CI)：1.58(1.26～1.97)]、較高AST[HR(95%CI)：1.73(1.31～2.28)]、ALP[HR(95%CI)：1.36(1.05～1.76)]、AFP[HR(95%CI)：2.09(1.85～2.12)]、較大腫瘤[HR(95%CI)：1.14(1.06～1.18)]、較低Alb[HR(95%CI)：1.38(1.37～1.52)]、miR-449a表達[HR(95%CI)：2.17(1.68～2.28)]是HCC患者死亡風險增加的獨立危險因素。見表3。

討 論

HCC根治性切除術患者的長期預后差異很大，這是由于其個體間的異質性、腫瘤負荷、肝功能、以及疾病病因等多方面決定的[5]。因此，發現影響HCC患者預后的潛在危險因子對改善HCC預后至關重要。異常的microRNA表達在包括肝癌在內的許多癌癥中是一個普遍存在的現象。有研究認為microRNA在HCC早期診斷和預后預測中有潛在的應用價值。

表2 HCC患者預后單因素生存分析

圖2 miR-449a表達與HCC患者總體生存相關性

變量例數HR(95% CI)PChild-Pugh分級 A239 1 B 29 1.11(1.07～1.15)<0.001ALT(IU/L) ≤40137 1 >40 131 1.58(1.26～1.97)<0.001AST(IU/L) ≤40108 1 >40160 1.73(1.31～2.28)<0.001ALP(U/L) ≤150209 1 >15059 1.36(1.05～1.76)<0.001Alb(μg/L) ≥34230 1 <34381.38(1.37～1.52)<0.001AFP(g/L) ≤2086 1 >20 182 2.09(1.85～2.12)<0.001腫瘤大小(cm) ≤586 1 >5182 1.14(1.06～1.18)<0.001miR-449a表達 ≥1.21811 <1.2872.17(1.68～2.28)<0.001

一篇納入8篇文獻，涵蓋亞洲和歐洲人群的meta分析發現，microRNA-449a在HCC患者中的表達水平降低于正常對照組[4]。然而，microRNA-449a對HCC患者預后影響的研究卻有限。本研究發現：Child-Pugh B級、較高ALT、AST、ALP、AFP水平、較大腫瘤、較低Alb水平、miR-449a表達下調可增加HCC患者死亡風險。這與先前的研究結果一致：miR-449a低表達是結腸炎相關直腸癌的預后的潛在預測因子[6]。miR-449a在非小細胞肺癌患者中表達下調[7]。miR-449a表達下調可增加胃癌患者的死亡風險[8]。miR-449a對腫瘤的作用機制仍然不清楚。先前的研究表明miR-449a通過抑制ADAM10的表達，阻止細胞增殖、細胞集落形成、HCC遷移和侵襲[9]。此外，miR-449a可通過抑制FOS和Met的表達以及抑制下游信號來抑制EMT和HCC的轉移。

綜上所述，miR-449a在HCC癌組織中的表達下調參與HCC的發生發展，miR-449a低表達患者預后更差，miR-449a可作為潛在的HCC治療靶點。