肝臟疾病中的膽管反應：致病機制與轉化意義

朱丹 詹淑華 馬世武

1957年，美國Popper等[1]較早報道了膽管反應(DR)，其特征是肝臟損傷誘導的反應性膽管增生。因膽管反應性病變不僅可由先前存在的膽管細胞產生，也可來自于肝細胞的膽管化生或活化和分化的肝祖細胞(HPCs)，所以在疾病狀態下用“膽管增生”來表示膽管樹和肝細胞界面上擴大的上皮細胞群是不正確的。根據病理特征，DR可以被描述為膽管細胞或HPC增殖，是一種對肝膽細胞的修復反應。DR期間的信號通路在不同的肝損傷或動物模型中可能是不同的。DR不僅常見于膽道疾病中，也可發生在酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、慢性病毒性肝炎、肝細胞癌等各類肝臟疾病中。

一、肝病中DR的來源細胞及其表型標記

參與DR反應的細胞可有不同來源，其表型標記有助于鑒別肝損傷中的膽管細胞、HPC和肝細胞(表1)。細胞角蛋白(CK)7或CK19被用于識別膽管細胞，而上皮細胞黏附分子(EpCAM)和性別決定區Y框蛋白 9(SOX9)被認為是HPC的標記物。然而，膽管細胞也表達EpCAM和SOX9，因此這些標記無法完全確定HPC增殖。現在已將Foxl1列為HPC標記，并證明表達Foxl1的HPC亞群在正常肝臟中很少見，但在由3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫可樂定(DDC)飲食引起的肝損傷中顯著增加。滋養層細胞表面抗原2(TROP2)和含有G蛋白偶聯受體5(Lgr5)的富含亮氨酸的重復序列也被認為是在DDC誘導的肝損傷中增殖的HPC的標志物。其他的HPC標志物還包括OV6、A6、CD24、CD133、神經膠質細胞抗原2(NGA2)和C-X-C族趨化因子受體4(CXCR4)。

通過對肝損傷組織進行免疫組化染色，計算CK7陽性標志物在DR中所占比例，可將DR分為5個等級[3]，即：0=無，1=<10%，2=10%～25%，3=26%～50%，4=>50%。根據DR分級，可以初步判斷患者病情嚴重程度，評分越高則損傷越嚴重。此外，從形態學上還可將DR分為I、II和III型，即I型指形成管腔規則的膽管結構，常見于膽道阻塞；II型是形成結構不完整的膽管樣結構，見于慢性活動性肝炎，可在匯管區看到小膽管結構；III型為形成由膽管上皮細胞和肝細胞共同重組的小膽管，見于肝臟亞大塊壞死后[4]。因此，根據DR的分型可以了解患者膽管結構狀態，從而判斷疾病的臨床類型。受疾病的病因及病情的演變等因素影響，病理觀察中的DR并非都能按上述分型標準一一對應，尤其是在出現相應并發癥的情況下。

表1 DR中膽管細胞、肝細胞和肝祖細胞的鑒別標記物

二、DR的信號傳導通路

DR中膽管細胞、肝細胞和HPC的增殖與信號通路密切相關。其中，Hippo-YAP/Notch信號傳導通路和HGF/c-Met信號傳導通路與轉分化成膽管細胞有關；Wnt/β-catenin信號傳導通路與向肝細胞的轉分化相關；TWEAK/Fn14信號傳導通路可誘導HPC和膽管細胞增殖，但仍不清楚肝細胞和膽管細胞是直接還是間接通過HPC轉分化而來。下面將從5種信號通路來詳細闡述DR轉分化相關的信號傳導通路。

(一)Notch信號傳導通路 誘騙寡核苷酸(Decoy-ODN) 是Notch受體的下游靶點，可通過抑制免疫球蛋白Kappa J區重組信號結合蛋白(RBP-jκ)減弱DDC誘導的小鼠肝纖維化，提示Notch信號通路與肝纖維化有關。在分離的小鼠HPC中，RBP-Jκ的過表達誘導HPC增殖以及HPC中CK7和CK19的表達升高，并且Notch信號抑制劑DAPT對Notch信號通路的抑制在體外減弱了那些細胞角蛋白的表達。在大鼠膽管結扎誘導的表達OV6或CK19的DR中，顯示出OV6/CK19和SOX9/CK19的共定位，以及膽管結扎誘導的Notch受體及其配體的表達水平升高。DAPT治療可減輕膽管結扎誘導的體內肝纖維化，并且在WB-F344細胞系中DAPT還可以抑制丁酸鈉誘導的HPC向膽管表型的分化。AAV8-TBG-Cre介導Notch受體中的一個亞型Notch1在肝細胞中的過表達可提高體內肝細胞中OPN和SOX9的表達。這些發現表明Notch信號通路與HPC和肝細胞轉分化成膽道表型有關，從而導致DR后肝纖維化。

(二)Hippo-YAP信號傳導通路 與無膽道閉鎖的患者相比，患有膽道閉鎖的患者的膽管高表達Yes相關蛋白(YAP)，它是Hippo信號通路的效應物。PSC和PBC患者膽管中YAP表達升高。YAP基因敲除小鼠在膽管結扎期間，顯示減弱的膽管增生，這表明DR與Hippo-YAP信號通路有關。研究發現，肝細胞特異性YAP表達可誘導HPC和膽管標志物(包括CK19、SOX9和A6)的表達升高，并且還顯示Notch信號通路是體內YAP的功能性靶點。這些結果表明通過激活Notch信號通路，Hippo-YAP信號通路能與DR和肝細胞轉分化成膽管細胞產生聯系。

(三)Wnt/β-catenin信號傳導通路 DDC飲食可以增加小鼠肝臟中表達A6的細胞數量，并且β-連環蛋白(β-catenin)與A6出現共定位。研究已經顯示在β-catenin基因敲除小鼠中，DDC飲食期間表達A6的細胞數量減少，這說明在膽道損傷期間β-catenin與DR有關。Wntless是Wnt蛋白的運輸和分泌所需的蛋白質，敲除Wntless導致Wnt蛋白的分泌不足和Wnt/β-catenin信號通路失活。研究表明，肝臟特異性Wnt-less敲除的小鼠在DDC飲食期間有低表達A6和CK19的DR和肝纖維化發生。在Lyz2-Cre介導的肝臟巨噬細胞中，Wntless的特異性缺失導致肝部分切除術后肝再生受損和細胞增殖減少。Wntless缺失的影響是有爭議的。然而，Irvine等已經證實，Lyz2-Cre介導的肝臟巨噬細胞中的Wntless缺失加劇了小鼠由硫代乙酰胺引起的表達CK的DR和肝纖維化[5]。根據Notch或Wnt/β-catenin信號通路，對小鼠使用膽堿缺乏乙硫氨酸補充(CDE)的飲食作為肝細胞再生模型和DDC飲食作為膽管細胞再生模型，探討了HPC在肝損傷過程中的命運。在該模型中，減少Notch信號傳導并維持Wnt/β-catenin信號傳導，導致CDE飲食期間肝細胞再生，并且Notch信號傳導被上調和Wnt/β-catenin信號傳導被下調，導致DDC飲食期間的膽管細胞再生。尚不完全了解肝細胞和膽管細胞再生兩者是否需要Wnt/β-catenin信號傳導,需要進一步的研究來闡明Wnt/β-catenin信號在各種肝損傷中的功能作用。

(四)HGF/c-Met信號傳導通路 人重組肝細胞生長因子(HGF)誘導肝部分切除術后大鼠肝再生。肝臟中Mx1-Cre介導的HGF受體c-Met缺失減少DDC飲食期間肝臟中表達CK19的DR和細胞增殖。與對照相比，肝細胞中Alb-Cre介導的c-Met缺失也減少了肝臟中表達A6 的HPC數量。用HGF處理肝細胞可誘導肝細胞轉分化為體外膽道表型。抑制 HGF/c-Met信號傳導的下游靶點磷脂酰肌醇3-激酶，可抑制肝細胞向膽管細胞的轉分化。這些結果表明，HGF/c-Met信號通路與肝細胞轉分化為膽管細胞有關。

(五)TWEAK/Fn14信號傳導通路 一項研究表明，CDE飲食誘導肝臟中成纖維細胞因子誘導基因14(Fn14)表達升高，Fn14與panCK發生共定位；該研究還表明，與野生型相比，Fn14基因敲除小鼠在CDE飲食期間顯示低表達A6 或CK19的DR，且作為Fn14配體的腫瘤壞死因子相關的細胞凋亡弱誘導因子(TWEAK)處理可誘導HPC細胞系增殖，BMOL細胞表明TWEAK/Fn14通路與DR相關[6]。在小鼠中，施用重組TWEAK可誘導表達panCK的DR。由Ah-cremediated鼠雙微基因2(Mdm2)缺失引起的嚴重肝細胞損傷后，敲除小鼠Fn14導致表達panCK的DR減少。重組TWEAK在Mdm2缺失小鼠中可誘導表達panCK的細胞擴增。盡管目前尚不清楚TWEAK/Fn14通路是否需要轉分化，但這些發現表明該通路與HPC和/或膽管細胞增殖相關，從而導致DR。

三、DR與臨床肝膽疾病

(一)膽汁淤積性肝病 膽汁淤積性肝病是指由肝內外各種原因引起膽汁分泌和排泄障礙，使膽汁不經膽小管排至腸腔而淤積于肝內，并可反流入血所造成器質性損傷、代謝失調和功能紊亂等一系列的肝膽疾病。DR常見于膽汁淤積性肝病患者，例如原發性膽汁性膽管炎(PBC)，原發性硬化性膽管炎(PSC)和膽道閉鎖(BA)。與健康個體相比，來自PBC或PSC患者的肝標本顯示出廣泛表達CK19、EpCAM和OV6的DR。從BA患者的肝切片中也鑒定出表達CK7的DR。

表2 各類肝臟病患者DR的鑒定

(二)酒精性肝病 大量飲酒會引起急性或慢性酒精性肝病，包括肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化。 酒精性肝炎是一種以嚴重的肝臟炎癥和纖維化為特征的嚴重酒精性肝病。酒精性肝炎患者DR中反應細胞來源于膽管細胞或HPC而非肝細胞，且DR分級與死亡率相關。

(三)非酒精性脂肪性肝病 非酒精性脂肪性肝病表現為與非酒精性肝病相似的肝臟脂肪變性，可逐漸導致非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。此外，肝纖維化程度越高的NASH患者DR評分越高，表明DR與NASH病情進展有關。

(四)慢性病毒性肝炎 在乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)陽性的肝硬化患者中觀察到表達CK19的DR增高，表明DR與病毒感染引起的肝硬化有關。此外，肝移植后HCV復發患者中也可觀察到表達CK7的DR。肝硬化或膽汁淤積性肝炎等較重的肝病患者DR高于HCV復發進展緩慢的患者，且肝纖維化分期與DR分級呈正相關。

(五)肝細胞癌 HBV相關性肝細胞癌(HCC)患者腫瘤周圍區域表達CK19的DR分級越高的患者炎癥分級或肝纖維化分期越高。由于在非侵襲性HCC患者中可觀察到高等級的DR，但在高侵襲性HCC患者中可發現低DR或無DR，因此DR可作為區分侵襲性和非侵襲性HCC的方法。

(六)DR與肝纖維化和衰老的關系 雖然肝星狀細胞(HSC)和門靜脈成纖維細胞是在肝損傷時導致纖維發生的主要細胞，但通過阻斷信號通路如分泌素/分泌素受體軸可抑制膽管細胞增殖和活化，同時通過減少轉化生長因子β1信號轉導可減弱HSC增殖和肝纖維化，表明膽管細胞活化與HSC纖維化之間存在密切關系。HSC的活化可通過產生HGF，從而與HPC增殖和肝再生有關。此外，IL-13可獨立誘導膽管細胞增殖以及成纖維細胞的活化和纖維化，抑制IL-13的作用可在體內減輕肝纖維化。 這些研究結果表明由于HSC與膽道細胞的密切關系，而肝纖維化通常伴隨DR，DR不僅可以發生在膽道疾病中，還可發生在由細胞因子調節的各種肝損傷中。說明DR及其分級作為肝損傷過程中肝臟狀態和纖維化標志的重要性，它可作為抑制肝纖維化和促進肝臟再生的治療靶點。

盡管膽管細胞向肝細胞的轉分化仍存在爭議，但由Mdm2缺失引起的肝細胞衰老可以誘導膽管細胞轉分化為肝細胞，表明細胞衰老與膽管分化有關。另外，飲酒會使肝細胞衰老，并且它與miR-34a表達的肝纖維化相關；HCV陽性患者肝細胞衰老和HPC增殖之間也存在相關性。這些結果表明肝細胞的衰老可能通過誘導膽道增殖或轉分化來驅動DR和纖維化發生。

四、結論與展望

目前的研究表明DR可發生在各種肝臟疾病中，但由于DR的復雜性，其類型和機制可能因肝損傷或動物模型而異。DR可在各種肝病的發病機制中起關鍵作用，并且與肝纖維化分期和死亡率等疾病狀況相關。在肝細胞和膽管細胞損傷期間，DR也是肝再生的重要因素，因此DR也可作為肝病治療的靶點。然而，目前尚不清楚DR是通過提高膽管質量和激活膽管細胞促進肝纖維化，還是在損傷期間通過促進肝再生來保護肝臟。這些內容對未來治療臨床肝膽疾病具有一定的價值。