應用RAD多肽展示體系制備抗hCG類抗體分子

劉夢雯，王美，王瓊，辛化偉,2

1 武漢科技大學 生命科學與健康學院，湖北 武漢 430065

2 臨沂大學 藥學院，山東 臨沂 276000

人絨毛膜促性腺激素 (hCG) 是人正常妊娠及某些惡性腫瘤發(fā)生中產生的多肽類激素[1-3]。hCG由胎盤合體滋養(yǎng)層細胞分泌，由α和β兩個亞基組成，以二硫鍵將其連結在一起形成二聚體結構[4-5]。hCG的α亞基與LH、TSH及FSH的α亞基基本相似，而β亞基的結構卻不一樣，hCG的生物學活性和免疫學特性主要取決于β亞基[6-7]。hCG-β也是正常妊娠及相關失調、妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的標識分子。另外，近期研究發(fā)現(xiàn)，在其他非滋養(yǎng)細胞來源的惡性腫瘤如卵巢癌、膀胱癌、結腸癌中，也顯示hCG-β的異常表達。因此，利用特異性的hCG結合分子檢驗血和尿中的hCG水平，在檢測極早期妊娠及惡性腫瘤過程中起著至關重要的作用。

當前包括hCG-β在內的疾病標識分子的臨床檢驗一直沿用基于單克隆抗體的免疫檢測技術[8-9]。近年來，隨著體外蛋白質 (及非蛋白質)識別分子技術的發(fā)展，應用非抗體蛋白骨架、通過多肽嫁接或置換篩選技術獲得特定蛋白的親和分子的方法逐漸受到人們的重視，并開始用于實驗室醫(yī)學分子檢驗的嘗試。但是，由于大多數(shù)蛋白骨架的可變位點有限，可容許大片段多肽嫁接的蛋白骨架較少，導致多肽嫁接后不能有效地結合目標分子。近期有研究報道，一種應用嗜熱古菌Pyrococcus furiosus的重組酶RadA分子的球形ATP酶結構域的蛋白質骨架 (簡稱RAD骨架)，可接納多肽、完整結構域甚至全長蛋白的插入、嫁接，具有其他蛋白質骨架所沒有的高度靈活性，并可在細菌中表達和快速生產，引起了研究者的注意[10]。這種蛋白質骨架還具有很高的熱穩(wěn)定性，不含半胱氨酸殘基，能容忍表面突變和缺失[11-12]。利用RAD骨架建立的多肽或蛋白展示體系 (RAD display) 制備類抗體分子，有望用于醫(yī)學標識分子等的檢測[13-14]。因此，本研究以hCG為檢驗分子，嘗試制備其RAD嫁接類抗體分子，并與單域嫁接抗體及商業(yè)單克隆抗體進行抗原結合活性比較，檢驗其應用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

pET30a(+) 質粒、pET30a(+)-sfGFP質粒由本實驗室構建；重組抗hCG-α抗體、重組抗hCG-β抗體-sfGFP融合蛋白 (cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP)，pCDNA3-hCG-α、LHB (促黃體生成素β亞基) 表達質粒，hCG-α+LHB轉染293T細胞分泌上清，由本實驗室制備；大腸桿菌E.coliDH5α和大腸桿菌E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞均由本實驗室制備；BCA蛋白含量檢測試劑盒購于碧云天公司；JEG-3細胞購于武漢普諾賽公司；hCG Antigen購自上海領潮公司；Anti-hCG-β/FITC購自北京博奧森公司；各種限制性內切酶購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自Thermo Scientific公司；Ni-NTA親和柱購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；基因合成由杭州金唯智公司完成；DNA測序由武漢擎科生物技術有限公司完成。

1.2 原核表達載體的構建

全基因合成P.furiosus重組酶RadA的ATPase結構域 (RAD展示骨架) 基因，在其上、下游分別引入BglⅡ和SalⅠ酶切位點，將其用BglⅡ和SalⅠ進行雙酶切，pET30a-sfGFP質粒用BamHⅠ和SalⅠ進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離，然后用T4 DNA連接酶將膠回收后的RAD基因片段和pET30a-sfGFP酶切DNA產物于22 ℃連接2 h，轉化至大腸桿菌E.coliDH5α，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質粒進行EcoR Ⅴ和SalⅠ雙酶切鑒定，并將雙酶切鑒定正確的陽性克隆送至武漢擎科生物技術有限公司測序。質粒圖譜如圖1A所示。

全基因合成hCG結合多肽插入RAD骨架L2環(huán)的嫁接RAD (后簡稱RAD/hCGBP) 基因序列，同樣在其上、下游分別引入BglⅡ和SalⅠ酶切位點，克隆到pET30a-sfGFP載體中，轉化至大腸桿菌E.coliDH5α，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質粒進行EcoR Ⅴ單酶切鑒定，并將酶切鑒定正確的陽性克隆送至武漢擎科生物技術有限公司測序。質粒圖譜如圖1B所示。

1.3 類抗體蛋白的表達

將質粒pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP分別轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)。分別挑取單克隆菌落搖種子，按1∶60 (V/V) 的接種量轉接。當OD值為0.6時，取部分未誘導菌液作為陰性對照。剩余部分加入0.5 mmol/L IPTG于18 ℃低溫誘導12 h，離心收集菌體沉淀，取一部分菌體沉淀用于檢測全菌蛋白；另一部分加入9倍體積的Buffer H緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mol/L NaCl，10%甘油，10 mmol/L β-巰基乙醇，30 mmol/L咪唑)，1倍體積10 mg/mL溶菌酶，0.1倍體積0.1 mol/L PMSF，混勻，冰浴超聲破碎20 min，離心分離上清和沉淀，用12% SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色檢測菌體全蛋白與超聲破碎后上清和沉淀中的蛋白。

1.4 類抗體蛋白的純化與SDS-PAGE鑒定

在適宜的誘導條件下 (18 ℃，120 r/min) 誘導類抗體蛋白的表達。收集誘導后菌體、取超聲破碎菌體后的裂解液上清，按照產品說明書，與Ni-NTA親和柱 (柱子平衡緩沖液：上述Buffer H)充分結合，以含0.075 mol/L咪唑的Buffer H洗脫雜蛋白，接著使用新鮮配制0.3 mol/L咪唑的H-Buffer洗脫目的蛋白，分別收集親和柱穿透峰和洗脫峰，用12% SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色檢測收集的蛋白。收集洗脫峰蛋白，透析去除咪唑。類抗體蛋白RAD-sfGFP和RAD/hCGBPsfGFP的理論分子量分別為57 kDa和58 kDa。

圖1 pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP質粒圖譜Fig.1 Plasmid maps of pET30a-RAD-sfGFP and pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP.(A) Plasmid map of pET30a-RAD-sfGFP.(B) Plasmid map of pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP.

1.5 類抗體蛋白濃度及抗原結合活性的測定

按照BCA蛋白含量檢測試劑盒說明書，測定樣品的蛋白濃度。

類抗體蛋白的抗原結合活性采用親和吸附-GFP熒光檢測方法進行測定。用包被緩沖液(碳酸鹽緩沖液pH 9.6，含5%新生牛血清)將anti-hCG-α稀釋至1 μg/mL，在每個96孔聚苯乙烯發(fā)光板的反應孔中加0.1 mL上述抗體稀釋液，4 ℃包被過夜。第二天，棄去孔內溶液，用PBST洗滌緩沖液瞬時洗3次，3 min/次，第3次要棄凈孔中溶液 (此過程為洗滌，下同)。分別加一定梯度稀釋JEG-3細胞 (人絨毛膜癌細胞：該細胞是從Erwin-Turner腫瘤的Woods系分離建立的6個克隆中的一個，可產生hCG) 分泌上清或hCG Antigen 0.1 mL于上述已包被孔中，37 ℃孵育1 h后洗滌，同時做空白孔對照。然后于各反應孔中，分別加入0.1 mL同濃度的RAD-sfGFP、RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP (應用單域抗體通用骨架cAbBCII10，以hCG結合多肽取代互補決定區(qū)CDR1或CDR3，制備的具有一定抗原結合活性的抗hCG單域抗體分子)、Anti-hCG-β/FITC，37 ℃孵育1 h，洗滌。于各反應孔中加入0.2 mL的PBS，于酶標儀上檢測熒光強度，激發(fā)光和熒光檢測波長分別為488 nm和525 nm。

1.6 類抗體蛋白滴度測定

按照同上包被步驟進行包被，加一定相同濃度JEG-3細胞分泌上清0.1 mL于已包被的反應孔中，37 ℃孵育1 h后洗滌，同時做空白孔對照。于各反應孔中，分別加入0.1 mL一定稀釋濃度的RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP、Anti-hCG-β/FITC，37 ℃孵育1 h，洗滌。于各孔中加入0.2 mL的PBS，檢測熒光強度。

1.7 類抗體蛋白的抗原結合特異性測定

按包被步驟進行包被，分別加一定相同濃度JEG-3細胞分泌上清或hCG-α+LHB轉染293T細胞分泌上清0.1 mL于上述已包被反應孔中，置37 ℃孵育1 h后洗滌，同時留空白孔對照。于各反應孔中分別加入 0.1 mL相同濃度的RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP、Anti-hCG-β/FITC，37 ℃孵育1 h，洗滌。于各孔中加入0.2 mL的PBS，檢測熒光強度。

1.8 類抗體蛋白的生化穩(wěn)定性測定

分別將RAD/hCGBP-sfGFP和cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP與足量的DP-GFP (一種GFP結合蛋白，本實驗室制備) 混勻，保證GFP標簽的穩(wěn)定性。取等份的上述混合物及Anti-hCG-β/FITC抗體分別置于4 ℃、16 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴鍋中水浴30 min，取出，恢復至室溫。各取100 μL上清于聚苯乙烯板中，檢測其熒光強度，分析類抗體蛋白的熱穩(wěn)定性。

取等份上述混合物及Anti-hCG-β/FITC抗體，用伯瑞坦-羅賓森 (Britton-Robinson) 廣泛緩沖液 (H3PO4-HAc-H3BO3) 調pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，于4 ℃放置30 min，取出，待恢復至室溫。各取100 μL于聚苯乙烯板中，檢測其熒光強度，分析類抗體蛋白的酸堿穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 原核表達載體的構建

重組子pET30a-RAD-sfGFP經EcoRⅤ和SalⅠ雙酶切鑒定后，結果所得2條目的帶大小大約為721 bp和5.4 kb，pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP重組子經EcoRⅤ單酶切鑒定后得到2條目的帶大小約為603 bp和5.5 kb，結果符合預期 (圖2)。酶切正確的重組質粒經測序結果證實，連入載體的目的序列與預期序列一致，密碼子閱讀框準確無誤，說明兩個重組質粒構建正確。

圖2 重組質粒pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP的構建Fig.2 Construction of pET30a-RAD-sfGFP and pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP recombinant plasmid.M1：1 kb DNA marker;M2：100 bp DNA marker;1：digestion of pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP with EcoRⅤ;2：digestion of pET30a-RAD-sfGFP with EcoRⅤand SalⅠ.

2.2 類抗體蛋白的表達

將pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBPsfGFP重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，收集細菌進行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色結果(圖3) 顯示，IPTG誘導后的E.coliBL21(DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP和E.coliBL21(DE3)/pET30a-RAD-sfGFP可見明顯的蛋白誘導條帶。這兩種蛋白在上清與沉淀中均有顯示，在上清中較多，說明可通過純化可溶性蛋白的方式純化目的蛋白。

2.3 Ni-NTA親和層析柱純化類抗體蛋白

將兩個重組質粒pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP轉化大腸桿菌誘導表達超聲后收集的上清，經Ni-NTA親和柱純化后，用不同濃度的咪唑洗脫液進行洗脫，獲得較高純度的類抗體蛋白，SDS-PAGE檢測分析純化結果(圖4) 表明，兩個轉化菌株的菌體裂解液上清樣品分別在約57 kDa和58 kDa位置有特異性蛋白條帶，與類抗體蛋白理論分子量大小相近，表明成功純化得到目的蛋白。

圖3 類抗體蛋白RAD/hCGBP-sfGFP和RAD-sfGFP的表達Fig.3 Expression of RAD/hCGBP-sfGFP and RAD-sfGFP fusion proteins.M：marker (10-170 kDa);1：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP,uninduced;2：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP,IPTG induced;3：pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP supernatant,IPTG induced;4：pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP precipitate,IPTG induced;5：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RADsfGFP,uninduced;6：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RADsfGFP,IPTG induced;7：pET30a-RAD-sfGFP supernatant,IPTG induced;8：pET30a-RAD-sfGFP precipitate,IPTG induced.

2.4 類抗體蛋白的濃度與抗原結合活性分析

通過BCA蛋白測定法可以得出RAD-sfGFP和RAD/hCGBP-sfGFP兩個類抗體蛋白的濃度分別為1.97 mg/mL、2.95 mg/mL。以anti-hCG-α蛋白作為捕獲抗體，以JEG-3細胞分泌含有hCG抗原的上清作為抗原，分別以RAD-sfGFP、RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC為探測抗體測定與hCG的結合活性，結果如圖5所示。除空白對照RAD-sfGFP外，其他4種蛋白對hCG均有一定結合活性，其中RAD嫁接類抗體 (RAD/hCGBP) 的抗原結合活性高于CDR3嫁接抗體 (CDR3/hCGBP3) 和CDR1嫁接抗體 (CDR1/hCGBP1)，且具有不低于Anti-hCG-β/FITC抗體的結合活性。

圖4 類抗體蛋白RAD-sfGFP和RAD/hCGBP-sfGFP的純化Fig.4 Purification of RAD-sfGFP and RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.(A) Purification of RAD-sfGFP fusion proteins.M：protein Mw marker (10-170 kDa);1：E. coli BL21 (DE3)/pET30a-RAD-sfGFP supernatant;2：flow-through of Ni-NTA affinity chromatography resin;3-6：elutions of Ni-NTA affinity chromatography resin.(B) Purification of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.M：protein Mw marker(10-170 kDa);1：E. coli BL21 (DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP supernatant;2：flow-through of Ni-NTA affinity chromatography resin;3-6：elutions of Ni-NTA affinity chromatography resin.

圖5 類抗體蛋白RAD/hCGBP-sfGFP結合hCG抗原 (JEG-3分泌上清) 的活性檢測Fig.5 Determination of hCG-binding affinity of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins (hCG antigen from the supernatant of JEG-3 cells).(A) hCG-binding curve against Ag (antigen) relative concentration.(B) hCG-binding curve against log2 of Ag (antigen) relative concentration.

以anti-hCG-α蛋白作為捕獲抗體，以商業(yè)化的hCG Antigen作為抗原，分別以上述5個蛋白為探測抗體測定與hCG的結合活性，結果如圖6所示。與單域抗體通用骨架嫁接的抗體相比，RAD嫁接類抗體 (RAD/hCGBP) 對不同來源的hCG抗原均展現(xiàn)了較高的結合活性。

2.5 類抗體蛋白的滴度分析

分別以梯度稀釋的RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC為探測抗體測定與hCG抗原 (JEG-3細胞分泌上清) 的結合活性，結果如圖7所示，3種分子結合hCG抗原的滴度測定曲線相似，滴度均為1∶20。

圖6 類抗體蛋白RAD/hCGBP-sfGFP結合hCG抗原 (hCG Antigen) 的活性檢測Fig.6 Determination of hCG-binding affinity of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins (hCG antigen from the hCG Antigen).(A) hCG-binding curve against Ag (antigen) relative concentration.(B) hCG-binding curve against log2 of Ag(antigen) relative concentration.

圖7 類抗體蛋白RAD/hCGBP-sfGFP的滴度分析Fig.7 Analysis on titer of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.

2.6 類抗體蛋白的抗原結合特異性分析

以JEG-3培養(yǎng)細胞上清液或hCGα+LHB轉染的293T細胞上清液作為抗原，以RAD/hCGBPsfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP或AntihCG-β/FITC為探測抗體，分別測定對兩種相似抗原 (hCG 和LH) 的結合特異性，結果如圖8所示，3種蛋白對hCG的結合活性均高于對LH的結合活性，差異顯著性相關 (P＜0.01)，并對LH存在一定的交叉結合活性；且RAD/hCGBP- sfGFP對hCG的結合特異性相對較高。

圖8 類抗體蛋白RAD/hCGBP-sfGFP的特異性分析(**P<0.01)Fig.8 Analysis of specificity of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins (**P＜0.01).

2.7 類抗體蛋白的穩(wěn)定性

通過圖9A可以看出，溫度對3種蛋白RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC的穩(wěn)定性均有很大影響。在37-50 ℃內其穩(wěn)定性較好，在70 ℃時幾乎完全喪失穩(wěn)定性。同樣，通過圖9B可以看出，pH對3種蛋白RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC的穩(wěn)定性也有很大影響。穩(wěn)定性在pH＜7的范圍內隨pH的降低而降低，在pH為4時幾乎喪失穩(wěn)定性，在pH＞8的范圍內穩(wěn)定性開始下降。

圖9 類抗體蛋白RAD/hCGBP-sfGFP的穩(wěn)定性分析Fig.9 Analysis of stability of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.(A) Stability of antibody protein at different temperature conditions.(B) Stability of antibody protein at different pH conditions.

3 討論

應用抗體/類抗體蛋白骨架制備新嫁接抗體/類抗體的技術是一種改善結合多肽的生化性能的重要手段[15]。理想的類抗體蛋白骨架具有分子量小、高水溶性和熱穩(wěn)定性等生化特征，其可以允許插入多肽、甚至更大的結構性肽段。在本項工作中，我們以來源于嗜熱古菌P.furiosus的RAD蛋白骨架制備hCG結合多肽的嫁接類抗體[4]，展示了優(yōu)異的hCG結合活性，并且嫁接類抗體的生化穩(wěn)定性等均與經典途徑制備的商業(yè)單克隆抗體相近[16-17]，暗示RAD骨架可能是一種較理想的多肽展示蛋白骨架。

應用多肽展示技術制備抗hCG抗體的工作已有研究者進行嘗試[18]。本研究結合前期研究對hCG結合多肽篩選工作和單域抗體通用骨架的選擇、測試工作的成果基礎上[19-20]，嘗試利用RAD新骨架進行多肽嫁接，獲得了具有較高抗原親和力的RAD嫁接類抗體分子。RAD嫁接類抗體蛋白在大腸桿菌中的表達較好，且高度可溶，并顯示出了較高的生化穩(wěn)定性，基本繼承了原蛋白骨架優(yōu)良的生化性能，也充分說明了RAD骨架的高度穩(wěn)定性[9]。與前期研究工作相符，RAD骨架的DNA結合L2環(huán)狀結構可以容忍序列多樣性，其置換甚至刪除均不影響蛋白質的穩(wěn)定性。我們測定了不同條件下RAD嫁接類抗體的穩(wěn)定性，最終發(fā)現(xiàn)RAD嫁接類抗體蛋白的穩(wěn)定性未受到干擾[21]。RAD蛋白骨架的穩(wěn)定性為插入多肽片段維持較恒定的空間構象提供了一定保障，可能是其抗原結合活性得以提高的主要因素。

在本項研究中，我們比較了RAD嫁接類抗體與應用單域抗體通用骨架的嫁接抗體 (CDR1嫁接抗體和CDR3嫁接抗體) 結合hCG抗原的活性情況，發(fā)現(xiàn)RAD嫁接類抗體展示了更好的抗原結合活性。類抗體分子的抗原結合活性主要取決于所接入的多肽片段，本研究所挑選的hCG結合多肽對hCG抗原具有較高的結合特異性，但與LH存在一定的交叉結合活性，為了提高其對hCG抗原的特異結合活性，可通過進行結合多肽的掃描突變等方法進行嘗試。

本研究建立了一個新的嫁接類抗體制備體系，并成功制備了hCG的類抗體，有望應用于臨床檢驗hCG水平，用于早期妊娠或腫瘤檢測。