胡蘿卜軟腐果膠桿菌CpxP蛋白純化及抑菌功能鑒定

苗蘭天，盧天華，何曉亮，周曉輝

河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050000

胡蘿卜軟腐果膠桿菌屬于革蘭氏陰性菌，是世界十大植物病原菌之一[1]，其亞種 (Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum，PC1) 是植物細菌性軟腐病的主要致病菌[2]，常危害胡蘿卜、白菜、馬鈴薯等植物[3]。除此之外，在北京市順義區的芹菜軟腐病[4]、南京市八卦洲的蘆蒿軟腐病[5]、甘肅省嘉峪關市的洋蔥鱗莖軟腐病[6]、山西市晉中的西葫蘆軟腐病[7]等病害樣品中都分離到PC1菌株，說明病原菌宿主范圍極廣。病原菌通過細菌Ⅲ型分泌系統分泌胞外水解酶，如蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等引發植物軟腐病[8-9]。目前，PC1菌株的全基因代謝網絡已成功構建，并用于篩選潛在的致病基因[10]。Cpx雙組分調控系統廣泛存在于革蘭氏陰性菌中，包含兩種重要功能蛋白：組氨酸蛋白激酶CpxA和反應調節蛋白CpxR，同時包含一種用于輔助調控系統的周質蛋白CpxP[11]。CpxP可以通過阻礙CpxA的接受域與外界環境信號傳導的化學信號相接觸，進而有效抑制CpxA對于整個調控系統的激活[12]。在沙門氏菌等致病性革蘭氏陰性菌及大腸桿菌模式菌中CpxP的主要功能為通過與CpxA的結合從而減少CpxA被不恰當誘導的機會，達到微調整Cpx系統的活性，使細胞不產生過度侵染反應[13]。因此，胡蘿卜軟腐果膠桿菌的Cpx雙組分系統對其致病性的調控也具有極其重要的作用[14]。目前，國內研究較多的是胡蘿卜軟腐果膠桿菌的分離鑒定[15]和其他一些抑菌基因的研究，如clpP[16]、mreB2、flgk[17]等。國外研究較多的是Cpx雙組分調控和細菌中其他調控系統的相互作用關系[18-19]。但是，CpxP蛋白的外源表達和抑菌功能在胡蘿卜軟腐果膠桿菌中的研究尚未見報道。

本研究利用分子克隆技術，將cpxP基因構建于表達載體pET-15b中，并在大腸桿菌Escherichia coliBL21 (DE3) 中實現異源表達，經二級純化后進行穩定性和抑菌功能分析，為蛋白結晶、結構解析和分子機理研究提供了前期實驗基礎，同時也為預防和防治胡蘿卜軟腐果膠桿菌提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

本研究中所使用的菌株是胡蘿卜軟腐果膠桿菌亞種 (Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum)，菌種號為DSM-30169，購于德國微生物菌種保藏中心 (DSMZ)；大腸桿菌E.coliDH5α感受態購于北京全式金生物科技有限公司；大腸桿菌E.coliBL21 (DE3) 購于北京博邁德基因技術有限公司；pET-15b質粒由柏林洪堡大學Hunke教授惠贈。

1.2 主要試劑、儀器和培養基

核酸限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ、T4 DNA連接酶均購自賽默飛世爾科技 (中國) 有限公司；DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司；蛋白marker、抗生素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 購自北京索萊寶科技有限公司；引物合成自華大基因；全波長酶標儀購自BioTek伯騰儀器有限公司 (美國)；Ni SepharoseTM6 Fast Flow 和 Sephacryl S-200預裝柱購自 GE Healthcare公司 (美國)；快速蛋白液相色譜儀(Fast protein liquid chromatography，FPLC)購自伯樂生命醫學產品有限公司 (上海)；新鮮的娃娃菜Brassica pekinensis、馬鈴薯Solanum tuberosum、胡蘿卜Daucus carota購自石家莊南栗市場。培養基為Luria-Bertani培養基。

1.3 基因組DNA的提取

取過夜培養的菌液2 mL，8 000 r/min離心1 min；300 μL TE重懸，450 μL細胞裂解液于80 ℃孵育5 min裂解細胞；恢復室溫后加入30 μL 10 mg/mL RNA酶37 ℃孵育15 min以清除RNA；加入150 μL蛋白沉淀液，高速振蕩1 min，冰浴5 min；13 000 r/min離心5 min處理除去蛋白沉淀，吸取上清液到新的離心管中；加入650 μL異丙醇輕柔顛倒直至出現絮狀白色DNA沉淀；加入450 μL 70%乙醇，12 000 r/min離心5 min棄上清，重復洗滌1次；干燥離心管，加入50 μL ddH2O水化溶解DNA沉淀并于4 ℃保藏備用。

1.4 重組質粒cpxP-pET-15b的構建

從NCBI數據庫中獲取編碼CpxP (Gene ID:29704421) 蛋白的核苷酸序列，用軟件Primer Premier在蛋白的編碼區進行引物設計。上游引物序列引入XhoⅠ酶切位點，下游引物序列引入BamHⅠ酶切位點。引物名稱及序列如表1所示。

PCR反應體系：基因組1 μL、10 mmol/L F-cpxP2 μL、10 mmol/L R-cpxP2 μL、10×HiFi 聚合酶緩沖液Ⅰ 10 μL、dNTPs 4 μL、HiFi 聚合酶 1 μL、ddH2O補至100 μL體系。PCR程序設置：94 ℃ 5 min、94 ℃ 40 s、57 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s、72 ℃ 5 min ，共38個循環；電泳檢測PCR結果并進行產物回收，將回收片段和pET-15b質粒分別進行雙酶切；使用T4 DNA連接酶過夜連接，轉化至大腸桿菌DH5α中。挑取轉化子進行菌落PCR驗證，對陽性菌進行抽提質粒和雙酶切驗證；將陽性質粒送至華大基因測序，并保藏測序結果正確的菌至-80 ℃冰箱用于后續實驗。

1.5 重組蛋白的誘導與表達

將上述構建成功的質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態細胞中，復蘇后涂布于含有青霉素和氯霉素的雙抗性平板上；挑取單菌落擴大培養，用于菌株保藏與種子培養基制備；按2%(V/V) 的轉接量轉接至含有雙抗的LB液體培養基，37 ℃、170 r/min恒溫培養2.5 h至OD600為0.5左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行蛋白誘導表達。降低溫度與轉速繼續恒溫培養至OD600為2左右，離心收菌于-20 ℃備用。

1.6 重組蛋白的分離純化及電泳檢測

用80 mL含有1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)、2.5 mol/L NaCl、10%甘油的細胞懸浮液重新懸浮細胞，并使用超聲破碎儀進行細胞破碎，工作時間30 min。將破碎液置于4 ℃、12 000 r/min高速冷凍離心10 min。取上清液再次置于4 ℃、40 000 r/min超速冷凍離心1 h，得到粗提蛋白樣品；使用鎳離子親和層析柱對粗提蛋白樣品進行純化，設置不同咪唑濃度的緩沖液進行蛋白洗脫。洗脫下來的蛋白進行凝膠過濾層析，將純化后蛋白進行濃縮處理得到高濃度的蛋白。在純化過程中取樣進行SDS-PAGE檢測。

1.7 重組蛋白穩定性測試

1.7.1 CpxP蛋白熱穩定性實驗

將CpxP蛋白從-80 ℃解凍后，各取500 μL裝在2個1.5 mL EP管中。EP管分別標記4 ℃和22 ℃。每隔24 h取樣，取樣前需經60 000 r/min、30 min超速離心。上清液直接制備樣品，沉淀用等量緩沖液懸浮后制備樣品。從0時刻開始，連續取樣6 d，通過SDS-PAGE檢測CpxP蛋白的熱穩定性。

1.7.2 CpxP蛋白pH穩定性實驗

使用無菌水，通過HCl溶液和NaOH溶液配制出pH值為4–12的水溶液。取9個1.5 mL EP管，分別裝450 μL不同pH的水溶液和50 μL CpxP蛋白樣品。混勻后放置于4 ℃冰箱。24 h后超速離心，上清液直接制備樣品，沉淀用等量緩沖液懸浮后制備樣品，通過SDS-PAGE檢測CpxP蛋白的pH穩定性。

1.8 重組蛋白的抑菌測試

1.8.1 CpxP蛋白抑菌定性實驗

平板抑菌定性試驗：活化的PC1菌液稀釋至1.0×106CFU/mL。取適量的菌液稀釋液均勻涂布在LB平板上。用無菌鑷子夾出牛津杯，小心豎放在平板上的中央位置。用微量移液器吸取蛋白水溶液，滴加到牛津杯中。需將平板在4 ℃冰箱中放置3 h，以便蛋白水溶液可以均勻擴散，之后在28 ℃過夜培養。

CpxP蛋白在娃娃菜葉片上抑菌定性試驗：取新鮮娃娃菜葉片，酒精消毒后自然晾干。將培養好PC1菌液稀釋到1.0×107CFU/mL，CpxP蛋白液稀釋到1、4、8 mg/mL；菌液和不同濃度的蛋白液1∶1混合于EP管中。依次取10 μL混合液連槍頭一起打入娃娃菜葉中，待混合液完全滲入菜葉中，拔出槍頭；無菌水作為陰性對照，純菌液作為陽性對照。28 ℃培養，實時觀察結果。

1.8.2 CpxP蛋白抑菌定量實驗

CpxP蛋白在胡蘿卜切片上抑菌定量試驗：取新鮮胡蘿卜，洗凈后切片，并在每片胡蘿卜中心做出1個小型凹槽，每片胡蘿卜凹槽大小相同。酒精消毒后自然晾干，將培養好PC1菌液稀釋到1.0×107CFU/mL，CpxP蛋白液稀釋到1、2、4、8 mg/mL；菌液和不同濃度的蛋白液1∶1混合于EP管中。在每一個凹槽內注入30 μL混合液。30 μL無菌水和8 mg/mL蛋白1∶1混合液作為陰性對照，純菌液作為陽性對照。28 ℃培養，實時觀察結果，測量時每孔測量3組數據。

CpxP蛋白在馬鈴薯切片上抑菌定量試驗：取新鮮馬鈴薯，洗凈后切片，并在馬鈴薯上做出5個相同大小的小型凹槽，酒精消毒后自然晾干。將培養好PC1菌液稀釋到1.0×107CFU/mL，CpxP蛋白液稀釋到1、2、4、8 mg/mL；菌液和不同濃度的蛋白液1∶1混合于EP管中。在每一個凹槽內注入30 μL混合液。28 ℃培養，實時觀察結果，測量時每孔測量3組數據。

2 結果與分析

2.1 重組質粒cpxP-pET-15b的構建

以提取的胡蘿卜軟腐果膠桿菌的基因組為模板擴增目的基因cpxP。將基因、質粒酶切后連接轉化，挑取轉化子菌落PCR驗證，并提質粒進行雙酶切驗證。結果如圖1所示，重組質粒 (泳道2) 分子量高于pET-15b質粒 (泳道1)，且被酶切下的基因片段 (泳道3，約500 bp) 送測序驗證結果與cpxP基因大小相同、相似度為100%，說明構建成功。

圖1 雙酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of double digested products.M:DNA marker;1:pET-15b plasmid;2:recombinant plasmid;3:double digestion of recombinant plasmid.

2.2 重組蛋白的Ni-NTA純化與分子篩純化

終濃度為1 mmol/L的IPTG可誘導CpxP蛋白在大腸桿菌BL21 (DE3) 高效表達，蛋白通過鎳離子親和層析純化，如圖2所示，左起泳道NI為未IPTG誘導的重組菌株，泳道Cell為菌株誘導后超聲破碎離心的上清液，對比NI可知，Cell中含有目的蛋白，泳道D為上清穿出液，蛋白膠中未見目的蛋白條帶，表明CpxP蛋白已經完全結合到了鎳柱上，而且蛋白量并沒有超過鎳柱的承載量。經過緩沖液1和2的沖洗，可以洗脫非特異性結合在鎳柱上的雜蛋白，之后再用較高濃度的咪唑洗脫目的蛋白。當咪唑濃度提升到150 mmol/L時可以洗脫大部分結合在鎳柱上的目的蛋白，隨著濃度提升到500 mmol/L可完全將目的蛋白洗脫，收集后濃縮，進行下一步純化。

使用Sephacryl S-200預裝柱進行純化。如圖3A所示，在軟件界面只顯示一個收集峰，無其他的雜峰出現，輸出峰的管數為28–39，取樣進行SDS-PAGE分析。如圖3B所示，結果顯示目的蛋白條帶出現在22 kDa附近，且蛋白條帶的大小和預測的蛋白分子量是相似的。SDS-PAGE顯示無其他雜蛋白出現，表明經親和層析及凝膠過濾層析兩步純化后獲得了高純度的CpxP蛋白，純度可達99%。

圖2 CpxP蛋白鎳離子親和層析分析Fig.2 Analysis of CpxP protein by nickel ion affinity chromatography.M:low molecular weight protein marker;NI:non-induced control;Cell:inducing supernatant of induced recombinant bacteria;D:flow-through after nickel-chelating affinity column;W:the last drop of buffer 2 eluate;E1-2,E1-3,E1-4:buffer 3 protein eluate;E2-2,E2-3:buffer 4 protein eluent.

圖3 CpxP蛋白凝膠過濾層析分析Fig.3 Analysis of CpxP protein by gel filtration chromatography.(A) Gel filtration chromatography peak map of CpxP protein.(B) SDS-PAGE verification of gel filtration chromatography results.M:low molecular weight protein marker;28–39:protein sample of tube 28–39.

2.3 重組蛋白的穩定性測試

蛋白熱穩定性結果如圖4A所示，CpxP蛋白水溶液在4 ℃和22 ℃條件下放置6 d，SDS-PAGE顯示沉淀和上清液條帶并無明顯變化，每24 h上清液的減少量和沉淀的增加量為0，說明其基本無降解，熱穩定性較好。

蛋白pH穩定性結果如圖4B所示，CpxP蛋白水溶液在不同pH值條件下處理24 h，蛋白電泳檢測條帶并沒有出現明顯的降解情況，說明CpxP蛋白對pH值的變化并不敏感，pH值穩定性較好。

2.4 重組蛋白的抑菌測試

在定性抑菌實驗中，平板抑菌試驗結果如圖5A所示，空白對照 (a孔和c孔) 并沒有出現抑菌現象，而加入蛋白水溶液 (b孔和d孔) 的實驗組出現抑菌現象，隨著蛋白量增加，抑菌圈擴大，判斷CpxP蛋白對胡蘿卜軟腐果膠桿菌有抑制作用。CpxP蛋白在娃娃菜葉片上的抑菌試驗結果如圖5B所示，在相同的侵染時間下，隨著蛋白的濃度增大，侵染面積會減小，呈現反比例關系。在蛋白濃度為8 mg/mL的情況下，病原菌被完全抑制。

在定量抑菌實驗中，CpxP蛋白在胡蘿卜切片上的抑菌試驗在28 ℃恒溫箱培養18 h，結果如圖6A所示，a和f分別為陽性對照和陰性對照，實驗組b、c、d、e隨著蛋白濃度增大，胡蘿卜軟腐果膠桿菌的侵染面積下降。統計病斑直徑和抑菌率如圖6B所示，陽性對照的平均病斑直徑為18.90 mm，當蛋白濃度為8 mg/mL時，平均病斑直徑降低為14.03 mm，抑菌率達到了44.89%。說明CpxP蛋白對胡蘿卜軟腐果膠桿菌有明顯抑制作用。

圖4 CpxP蛋白穩定性分析Fig.4 Analysis of CpxP protein stability.(A) Stability of CpxP protein at 4 °C and 22 °C.(B) Stability of CpxP protein under different pH conditions.

圖5 CpxP蛋白抑菌定性試驗結果分析Fig.5 Analysis of antibacterial qualitative test results of CpxP protein.(A) Plate antibacterial test results.a:50 μL sterile water;b:50 μL protein aqueous solution;c:100 μL sterile water;d:100 μL protein aqueous solution.(B) Effects of different infestation time on the leaf of the doll.e:infestation for 18 h;f:infestation for 30 h;g:infestation for 42 h;well 1:10 μL PC1 bacterial solution with water;well 2:10 μL sterile water;well 3–5:10 μL PC1 bacterial solution with 1,4,8 mg/mL protein,respectively.

圖6 CpxP蛋白在胡蘿卜切片上抑菌定量試驗結果分析Fig.6 Analysis of antibacterial quantitative test results of CpxP protein on carrot slice.(A) Quantitative test results of carrot slice bacteriostatic test.a:15 μL PC1 bacterial solution with 15 μL sterile water;b–e:15 μL PC1 bacterial solution with 1,2,4,8 mg/mL protein,respectively;f:15 μL sterile water with 15 μL 8 mg/mL protein.(B) Carrot slice bacteriostatic quantitative test rot diameter and inhibition rate statistical results.

CpxP蛋白在馬鈴薯切片上的抑菌試驗在28 ℃恒溫箱培養18 h，結果如圖7A所示，a為陽性對照，實驗組b、c、d、e隨著蛋白濃度增大，胡蘿卜軟腐果膠桿菌的侵染面積同樣出現下降的趨勢。統計病斑直徑和抑菌率如圖7B所示，陽性對照的平均病斑直徑為21.33 mm，說明胡蘿卜軟腐果膠桿菌更易侵染馬鈴薯，但是從抑菌率上看CpxP蛋白在馬鈴薯切片上的效果要好于在胡蘿卜切片上的效果。當蛋白濃度為8 mg/mL時，平均病斑直徑降低為13.59 mm，抑菌率達到59.41%。

圖7 CpxP蛋白在馬鈴薯切片上抑菌定量試驗結果分析Fig.7 Analysis of antibacterial quantitative test results of CpxP protein on potato slice.(A) Quantitative test results of potato slice bacteriostatic test.a:15 μL PC1 bacterial solution with 15 μL sterile water;b–e:15 μL PC1 bacterial solution with 1,2,4,8 mg/mL protein,respectively.(B) Potato slice bacteriostatic quantitative test rot diameter and inhibition rate statistical results.

3 討論

CpxP存在于細胞的周質空間，結構上呈現二聚體構型，是由兩個“左手狀”單體相互纏繞而形成的功能蛋白[12,20]。Stefanie 等[21]發現Cpx雙組分系統可以影響細菌毒力的強弱，但在不同的菌株中有著不同的外在表現。研究表明將鼠傷寒沙門氏菌中的cpxA信號接收域敲除后，該菌對真核細胞的入侵能力明顯減弱，cpxA的缺失突變株使該菌在小鼠體內的存活率大大降低[22]。Irina等[23]研究發現缺失Cpx系統后，尿道致病性大腸桿菌的毒力降低，同時侵染力和對抗生素的抗性也出現同步下降的趨勢。但是杜克嗜血桿菌的cpxAR突變株對人類的感染力明顯增強[24]，說明原本存在的Cpx系統的激活能夠有效增加其致病力。而在胡蘿卜軟腐果膠桿菌中，Cpx雙組分調控系統的激活也應是依靠外界環境信號的刺激，如膜壓力變化、pH值變化等。在沙門氏菌等一些致病革蘭氏陰性菌中，當CpxA蛋白的輸入域接收到外界刺激，其會自磷酸化，之后將磷酸基團轉移至CpxR蛋白上使其構象改變，從而激活CpxR蛋白，CpxR蛋白控制著病菌的一些毒力基因(hilD、hilA、icmR)表達[13,25]，使得菌株獲得侵染性。但是，課題組前期的研究發現[12]，大腸桿菌中過表達的CpxP蛋白可以下調Cpx雙組分的應激調控。原因在于CpxP蛋白的二聚體構象如同“帽子”一般，“扣在”了CpxA蛋白上，這種作用結果是由正負電荷結合帶來的，使得CpxA的輸入域不能夠同信號分子相接觸，從而適時關閉Cpx調控系統，以致CpxA/R蛋白不能被激活，不能控制下游的毒力基因的表達。此時菌體外在的表現為侵染性降低，CpxP蛋白表現出抑菌效果。由其抑菌機理可知，CpxP蛋白是間接參與調控Cpx雙組分的蛋白，其抑菌作用是抑制Cpx雙組分系統激活開關的結果[26]。本研究通過表達高純度的CpxP蛋白的體外抑菌實驗，確定了CpxP蛋白的體外應用也可起到對胡蘿卜軟腐果膠桿菌的抑制作用，其抑菌機理可能是可透過菌體外膜通過抑制其雙組分系統的激活從而達到其抑菌效果的。

植物軟腐病常見的物理防治有翻耕土壤，破壞病原菌生存環境或輪作種植、及時清除害病植株、管控施肥并嚴防蟲害等[27]，清除病原菌附著體，切斷病原菌傳播路徑，對于預防植物軟腐病的發生有著極大的幫助。目前，不得不承認化學防治依舊是防治植物軟腐病的主要手段，但是化學藥劑的長時間大量施用對大自然的生態環境和人類的生命安全也造成了威脅。抗生素防治方法多見于肌霉素、氧霉素、十眾霉素、麥芽糖酯酶等[28]，但是長久如此，病菌耐藥性增加，防治的效果會越來越差。所以尋求合適的生物防治方法尤為迫切，CpxP蛋白的體外抑菌實驗的證實，為將來的農業應用提供了參考。

4 結論

本研究利用基因工程技術成功構建原核表達質粒cpxP-pET-15b，并在大腸桿菌表達菌株中實現了CpxP重組蛋白的高效異源表達，并通過鎳離子親和層析和凝膠過濾層析得到了高純度重組蛋白。同時，驗證了CpxP蛋白擁有良好的熱穩定性和pH穩定性。抑菌試驗中，CpxP蛋白在胡蘿卜切片上的抑菌率為44.89%，在馬鈴薯切片上的抑菌率為59.41%。以上結果為進一步研究該蛋白的空間結構、抑菌機理提供了物質基礎，也為軟腐病的預防和防治提供了新的思路。