三基因聚合改良恢復系福恢673的稻瘟病抗性

陳志偉，官華忠，王曉方，董瑞霞，卓成海，毛大梅，潘潤森，周元昌，吳為人

1 福建農林大學 福建省作物設計育種重點實驗室，福建 福州 350002

2 福建省農業科學院水稻研究所，福建 福州 350003

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界上50%的人口以水稻為主食。稻瘟病是水稻的三大病害之一，由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae引起的，全球每年因該病造成水稻產量損失10%-15%，給農民造成數十億美元的經濟損失[1]。稻瘟病在我國華南、西南、長江中游和東北地區等水稻主產區都會發生危害，年發病面積達330萬-570萬hm2，產量損失達數億公斤，給我國水稻生產帶來了很大安全隱患[2]。而選育和推廣抗稻瘟病品種是目前防治該病害最經濟、最有效的方法之一[3]。目前，已超過100個主效稻瘟病抗性基因被鑒定出來，其中30個抗性基因已被成功克隆[4-5]。已有多個研究表明，多個稻瘟病抗性基因的聚合可拓寬抗譜，延長品種抗性年限[6-7]。來源于西非粳稻品種LAC23的Pi-1是一個廣譜高抗稻瘟病基因[8]。來源于小粒野生稻的Pi-9基因也是一個抗性很強的稻瘟病抗性基因，該基因對來自不同國家的40多個稻瘟病毒性菌株的抗性接近免疫水平[9]。水稻品種Tetep中攜有的抗稻瘟病基因Pikh是一個主效基因，該基因對印度的許多稻瘟病菌生理小種均具有抗性[10]。劉文德等利用從福建省水稻產區采集的108個稻瘟菌代表菌系，對30個水稻抗稻瘟病近等基因系或單基因系品種進行抗病基因的抗譜分析，發現抗稻瘟病基因Pikh、Pi-1和Pi-9(t)抗性較強，抗性頻率均達80%以上，其中Pi-kh的抗性頻率達98.15%[11]。由于這3個抗病基因均為顯性抗性基因，因此，針對這3個基因進行聚合育種有望育成稻瘟病抗性較好的水稻品種。

福恢673是福建省農業科學院水稻研究所育成的恢復力強、配合力好、綜合性狀穩定的恢復系[12]，但其稻瘟病抗性一般。金恢1059是福建農林大學前期通過分子標記輔助育種技術育成的攜有Pikh、Pi-1和Pi-9(t)抗性基因的抗稻瘟病恢復系，該恢復系抗性好、米質優，但配合力欠佳。本研究以攜有3個抗病基因的抗源R1059為抗性供體親本，以福恢673為受體親本，通過傳統的回交育種技術，結合分子標記輔助選擇技術，將稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-9和Pi-kh導入福恢673中，以期育成保留福恢673優良特性但稻瘟病抗性得到改良的新恢復系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗性供體親本：金恢1059，是福建農林大學前期通過分子標記輔助選擇技術育成的攜有來源于75-1-217 (Pi-9)、C101LAC (Pi-1) 和IRBLkh-K3(Pi-Kh) 的3個抗病基因。

輪回親本：福恢673，系福建省農業科學院水稻研究所選育的強恢復系[12]，利用該恢復系已配制出內6優673、華兩優673、廣8優673、贛優673、聚兩優673、廣優673、川優673、宜優673、天優673、Ⅱ優673和京福1優673等10多個雜交稻新組合通過省級以上審定。

1.2 分子育種的主要技術路線

將攜有Pi-1/Pi-9/Pi-Kh的供體親本金恢1059與福恢673雜交，雜交F1代再與輪回親本福恢673回交。于下一生產季種值BC1F1代，于抽穗期通過株高、生育期、穗部性狀等選擇出一批株葉形態與輪回親本最像的單株，再通過與目標抗性基因緊密連鎖的分子標記MRG4766[13]、FP1+FP2+RP[14]和RM206[15]對Pi-1、Pi-kh和Pi-9進行跟蹤選擇，中選單株繼續與福恢673回交；BC2F1和BC3F1的處理方法參照BC1F1代；于BC3F1代，中選的單株自交收種獲得BC3F2種子；在BC3F2代，通過株葉形態和標記選出3個抗病基因位點均為純合抗病標記基因型的單株；這些單株收種后進行配合力測定、田間抗性鑒定等篩選，最終選出抗性、配合力、株葉形態等綜合性狀最好的株系。

主要技術路線如圖1所示。

1.3 抗病近等基因系的鑒定

1.3.1 近等基因系的分子鑒定

分別利用MRG4766[13]、FP1+FP2+RP[14]和RM206[15]分別對本研究前期選育出改良株系進行Pi-1、Pi-9和Pi-kh的標記基因型鑒定，同時在整個基因組均勻挑選68對均勻分布的SSR (Simple sequence repeats) 引物對育成的近等基因系進行標記基因型檢測，并利用NTSYS 2.0軟件進行聚類分析，并評估各近等基因系遺傳背景恢復為輪回親本的比例。

1.3.2 近等基因系抗性表型鑒定

室內采用混合稻瘟病菌株對輪回親本福恢673及改良株系、福恢673及改良株系與宜香A組配的F1進行鑒定，在水稻幼苗生長至3葉1心時進行噴霧接種，7-8 d后記載各供試品種葉片病斑的發病等級，記載時以每一株葉片上最高發病級別的病斑為該株發病的級別。田間誘發鑒定在福建省上杭縣茶地鄉進行，將育成的改良株系以及其改良株系與宜香A配制的F1、R1059(抗病對照)和感病對照品種 (福恢673和宜優673)，采用旱圃直播的方法進行苗期田間誘發，每個品種播30粒種子，2次重復，以發病高的小區為該測試品種的抗性定級標準。

圖1 抗病近等基因系的選育過程Fig.1 Breeding procedure of the resistant Near-isogenic Lines.

1.4 雜種優勢鑒定和應用前景分析

1.4.1 近等基因系的篩選

由于本研究的回交親本福恢673配制的組合中，與宜香A配制的宜優673為該親本配制的雜交稻品種中應用面積最大的組合。因此本研究通過選育出的抗病近等基因系與優質不育系宜香A配制F1，在福建沙縣通過三重復品種比較試驗，比較育成的抗病近等基因系配制的宜優組合與輪回親本福恢673配制的宜優673的生育期、株高、每穗粒數、有效穗數、穗長、結實率、千粒重、產量等主要農藝性狀，分析這些株系是否保持福恢673的基本特性，以期選出綜合性狀最好的株系，進一步進行育種應用。

1.4.2 改良株系的育種應用評價

分析中選的抗病近等基因系配制的雜交稻組合在各級區試中的產量、抗性、生育期等綜合表現，初步評價新選育的抗病恢復系的應用前景。

2 結果與分析

2.1 近等基因系的選育過程

采用1.2.1所述的分子育種技術方案，2010年秋季在福建省泰寧縣先用攜有3個稻瘟病抗性基因 (Pi-1、Pi-9和Pi-kh) 的恢復系金恢1059與恢復系福恢673雜交，獲得F1種子；2010年冬季的海南省三亞市種植F1和福恢673 (作為輪回親本)，于F1抽穗期取穗與福恢673回交，獲得BC1F1種子231粒；2011年秋季在沙縣種植BC1F1，抽穗時選生育期、株高、穗型、粒型等株葉形態選出株葉形態較像福恢673的單株147株，利用MRG4766 (與Pi-1緊密連鎖)、FP1+FP2+RP (與Pi-9緊密連鎖) 和RM206 (與Pi-Kh緊密連鎖) 對通過株葉形態選出的單株進行標記鑒定，從中獲得在3個抗病基因位點均為雜合抗性標記基因型的單株14株，從這14株雜合抗病標記基因型的單株中再選出6株與福恢673繼續回交，獲得BC2F1種子178粒，于2011年冬季在海南省種植BC2F1植株158株，通過株高、生育期、粒型等選出72株株葉形態與福恢673相近的單株，通過標記進行前景選擇獲得7株在3個抗病基因位點均為雜合抗病標記基因型的單株，利用這7個單株繼續與福恢673進行回交獲得BC3F1種子，2012年秋季在沙縣種植BC3F1179株，通過株葉形態和分子標記選擇選出10個株葉形態與福恢673高度相似且在3個抗病基因位點均為抗病標記基因型的單株，這些單株套袋自交獲得BC3F2種子；2012年冬季在海南省種植BC3F2株系群體，最終通過株葉形態和標記輔助選擇，篩選出10個株高、生育期、穗型和粒型等均與輪回親本高度相似且3個抗病基因位點均為抗病標記基因型的單株 (每個BC3F2選1株)，收套袋自交種，獲得10個改良后的近等基因系。2013-2014年在福建省內和海南省進行加代、各近等基因系的抗性鑒定和雜種優勢分析，篩選出保留原親本優良特性但稻瘟病抗性得到改良的新恢復系福恢683。

2.2 近等基因系的分子鑒定

2.2.1 目標基因的鑒定

圖2 近等基因系中目標抗性基因的鑒定Fig.2 Identification of target genes in the NILs,amplified with primers RM206 (A),FP1+FP2+RP (B)and MRG4766 (C).Lanes 1-10,11 and 12：amplification products of near-isogenic lines 1 to 10,R1059 and Fuhui 673.

利用 MRG4766 (與Pi-1緊密連鎖)、FP1+FP2+RP (與Pi-9緊密連鎖) 和RM206 (與Pi-Kh緊密連鎖) 對10個福恢673的改良后代株系進行檢測，結果如圖2所示。從圖2可以看出，10個改良株系在RM206、FP1+FP2+RP和MRG4766位點與受體親本福恢673均存在多態性，且改良株系的擴增帶型均與供體親R1059一致，說明這10個抗病近等基因系在Pi-1、Pi-9和Pi-Kh位點均為純合抗病標記基因型，表明本研究前期通過分子標記對目標基因進行輔助選擇是準確的。

2.2.2 遺傳背景恢復比例評估

為了初步評估本研究選育出的10個改良株系的遺傳背景恢復為輪回親本福恢673的比例，本研究根椐已公布的水稻SSR標記在水稻12條染色體的位置，從中均勻地選出68個SSR標記，利用這些標記對改良株系進行標記基因型檢測，根據兩親本的擴增帶型 (分別記為1或0)，最后根據這68個標記的帶型，對各改良株系及兩親本進行聚類分析，結果如圖3所示。從圖3可以發現，本研究選育出的10個改良株系與輪回親本福恢673均被劃分到同1個群，相似系數在92.96%-98.59%之間，其中一個株系 (Line 7) 與輪回親本福恢673相似系數達98.59%。該結果表明，本研究所選育的10個改良株系90%以上的遺傳背景已恢復為輪回親本福恢673。

2.2.3 抗性表型鑒定

為了明確福恢673的改良株系對稻瘟病菌的抗性反應，本研究在苗期進行了室內混合菌株抗性鑒定和田間自然誘發鑒定，結果如表1所示。室內混合接菌結果表明，各改良株系及其改良株系與宜香A組配的F1對混合稻瘟病菌的抗性表現均為抗病 (R)，除了改良株系Line 7和Line 8與宜香A組配的F1有少量病斑外 (病情指數分別為0.37%和4.17%)，其他均無發病情況，抗性表現與抗病對照R1059的抗性結果一致 (無病斑)，而感病對照品種福恢673和宜優673病情指數分別為60.00%和60.73%，遠遠高于改良系和改良系配制的雜種的抗性，兩者的抗性綜合評價為感病 (S) 和高感 (HS) (表2)；田間自然誘發鑒定表明，10個改良株系、改良株系與宜香A組配的F1、抗病對照品種R1059均無病斑，表現抗病(R)，而福恢673和宜優673均表現為感病 (圖4)。從室內混合菌株接菌鑒定和苗期自然誘發鑒定的綜合結果來看，本研究獲得改良株系及其配制的雜種的稻瘟病抗性均得到大大提高，表明本研究通過基因聚合技術改良福恢673的稻瘟病抗性是成功的。

圖3 改良株系及其親本的聚類分析圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of the NILs and their parent.

表1 改良株系及其F1的抗性表現Table 1 Resistance performance of the NILs and their hybrids

表2 近等基因系與宜香A配制的雜種表現Talbe 2 Agronomic characters of hybrids between the NILs and Yixiang A

圖4 代表性株系及其雜種的田間抗性表現Fig.4 The resistance performance of typical lines and their F1 in the field.From left to right,Fuhui 673(susceptible control line),Yiyou 673 (susceptible control hybrid),Line 9,Yixiang A/Line 9,R1059 (resistant control line) and Yixiang A/R1059 (resistant control hybrid).

2.2.4 近等基因系的雜種優勢分析

為了進一步明確福恢673的抗病近等基因系是否保留福恢673的主要優良特性，將福恢673和福恢673各抗病近等基因系與宜香A配置雜種F1，通過三重復品種試驗進行產量比較，結果見表2。從表2可以看出，這些近等基因系與宜香A配制的雜種一代畝產在538.9-611.7 kg之間，2個株系配制的雜種 (宜香A/Line 9和宜香A/Line 1) 對照增產達極顯著水平，增產幅度分別為3.64%和3.21%，2個株系配制的雜種 (宜香A/Line 8和宜香A/Line 7) 對照增產達顯著水平，增產幅度分別為1.34%和1.20%，2個株系配制的雜種產量比輪回親本福恢673配制的雜種宜優673差異不顯著 (宜香A/Line 5和宜香A/Line 2)，減產幅度分別為0.07%和0.15%，1個株系配制的雜種 (宜香A/Line 6) 比對照減產1.52%差異達顯著水平，而有3個株系配制的雜種(宜香A/Line 3、宜香A/Line 4和宜香A/Line 10)，其減產幅度在-8.69%-6.44%之間，與對照宜優673的差異達極顯著水平。

在全生育期方面，近等系配制的宜香優組合全生育期在128.5-131.7 d之間，與對照宜優673相差在-2.7-+0.5 d之間；在株高方面，近等基因系的雜種一代株高在122.2-127.9 cm之間，與對照宜優673株高差異在-1.3-+4.4 cm之間；在穗長方面，近等系配制的宜香優組合穗長在24.6-28.5 cm之間，與對照宜優673相差在-2.8-+1.1 cm之間；在有效穗方面，近等系配制的宜香優組合全有效穗在17.2-18.8萬穗之間，與對照宜優673相差在-0.5-1.1萬穗之間；在每穗粒數方面，近等系配制的宜香優組合穗粒數在128.1-149.0粒之間，與對照相差-7.6-3.6粒，在結實率方面，近等基因系配制的雜種結實率在67.8%-79.1%之間，與對照相差-7.6%-3.7%；僅3個近等基因系配制的雜種結實率低于70%。在千粒重方面，近等基因系的雜種在31.0-32.1 g之間，與對照相差-7.6%-3.7%。因此，近等基因系配制的雜種與輪回親本的主要農藝性狀基本相似。

2.2.5 近等基因系的應用前景分析

1) 福恢673與福恢683的DNA指紋比較

由于本研究10個近等基因系配制的雜種中，有2個株系 (Line 9和Line 1) 配制的雜種比對照明顯增產且生育期比對照短，但Line 1配制的雜種株高比Line 9高了3.2 cm，故本研究確定Line 9為首選的改良系，定名為福恢683。但是，Line 1、Line 2、Line 5、Line 7和Line 8與宜香A配制的雜種產量均與福恢673與宜香A配制的雜種產量減產差異不顯著或增產，因此，這些株系也有待進一步鑒定和利用。

為了比較新育成的抗病恢復系福恢683的DNA指紋與輪回親本福恢683的DNA指紋差異，本研究根據目前現行的水稻品種DNA檢測標準——水稻品種鑒定技術規程SSR標記法(NY/T 1433-2014)，分析了該標準規定的48個SSR標記在福恢683和輪回親本福恢683的多態性，發現有4個標記 (RM190、RM224、RM481和RM119) 在兩親本間存在多態性(圖5)，而根據現有的行業標準，福恢683和福恢673可被認定為不同的品種，因此，福恢683 (Line 9) 可以作為新的抗病恢復系應用于生產。

2) 福恢673的應用前景

圖5 福恢683和福恢673的DNA指紋比較Fig.5 Comparison of DNA fingerprints between Fuhui 683 and Fuhui 673.The names of polymorphic markers were shown under the lanes.

雜種的產量表現：利用福恢683配制的雜交稻新組合兩優7283 (272S/福恢683) 和金泰優683 (金泰A/福恢683) 已于2018年分別通過福建省和湖北省審定。兩優7283在2016年的福建省科研聯合體晚稻區試中，平均畝產553.48 kg，比對照宜優673增產9.32%，增產達極顯著水平，產量居該組第2位，增產點率85.7%；2017年參加福建省科研聯合體晚稻續試，平均畝產530.25 kg，比對照宜優673增產3.15%，增產達顯著水平，居該組第3位，增產點率80%。2017參加福建省晚稻生產試驗，平均畝產550.04 kg，比對照宜優673增產9.34%；金泰優683在2015年參加湖北恩施早中熟中稻品種組區域試驗中，平均畝產542.47 kg，比對照綿5優142增產15.14%，增產達極顯著水平，居第1位；6個試驗點種植，均比對照品種增產，增產點比率100.0%。2016年續試，平均畝產618.50 kg，比對照綿5優142增產15.28%，增產達極顯著水平，居第1位；6個試驗點種植，均比對照品種增產，增產點比例100.0%。2015-2016年兩年區試平均畝產580.49 kg，比對照綿5優142增產15.22%。兩年的12個試驗點均比對照品種增產，增產點比例100.0%。2017年生產試驗平均畝產557.82 kg，比對照增產8.20%，居第2位。因此，金泰優683也是一個產量高、穩產性較好的雜交稻組合。由此可見，福恢683配制的組合產量高、豐產性和穩產性較好。

雜種抗性表現：根據金泰優683在湖北省恩施州兩年的抗性表現，其稻瘟病綜合抗性指數2.4，穗瘟損失率最高級3級，綜合評價為中抗稻瘟病，由于金泰優683的母本金泰A田間抗性表現為高感，故可推斷金泰優683的抗性來自于父本；而根據兩優7283在福建省兩年的抗性表現，其兩年的稻瘟病綜合評價為中抗稻瘟病，而兩優7283的母本272在福建省表現為高感，輪回親本福恢673與宜香A配組的對照品種宜優673綜合評價為高感稻瘟病。該結果也再次證實了改良株系的稻瘟病抗性得到了很大的提高。上述結果表明，本研究改良后的近等基因系配制的雜種稻瘟病抗性得到明顯的提高，進一步證實了本研究中對目標基因進行聚合改良感病雜交稻親本的抗性是有效的。

3 小結與討論

隨著越來越多水稻有利基因的發現及其相關分子標記的開發，我國育種家在水稻抗白葉枯病、抗稻瘟病、抗褐飛虱、抗稻癭蚊、條紋葉枯病、抗稻癭蚊等抗病蟲、蠟質基因(wx)、香味基因fgr、糊化溫度等品質性狀的分子標記輔助育種均取得了顯著的進展[16-23]，但是，針對雜交稻親本，同時對3個稻瘟病抗性基因進行標記輔助育種的研究鮮見報道。本研究通過一次雜交、三次回交和一次自交，同時通過與Pi1、Pi-kh和Pi9這3個目標抗性基因緊密連鎖的分子標記對目標抗病基因進行選擇，最終育成了10個遺傳背景恢復比例為92.96%-98.59%的近等基因系，利用宜香A與這10個近等基因系配制的組合中，有6個株系與宜香A配制的F1代比原來親本配制的F1代雜種優勢強或相近，該結果表明，本研究選育的多數回交后代基本保留了輪回親本的主要優點。從本研究初步篩選出的近等系所配組合在區試中的表現看，兩優7283 (272S/Line 9) 和金泰優683 (金泰A/Line 9) 均表現豐產性、穩產性好等特點，該結果也進一步說明本研究選育的新株系配制的組合產量性狀好。

本研究中涉及的Pikh、Pi-1和Pi-9(t)為劉文德等[11]利用30個水稻抗稻瘟病近等基因系或單基因系品種，用收集自福建省水稻產區的108個稻瘟菌代表菌系進行抗譜分析而篩選出的3個抗譜最寬的抗性基因，但本實驗室利用攜有單個抗病基因的不育系金抗1A (攜Pi-1)[21]、M76A (攜Pi-1)[12]、M20A[22](攜Pi-9) 與抗性一般的父本配制的組合 (閩標優1095[23]、M76優3301[24]和M優2155[25]) 在福建省的區試中的抗性均表現為中感稻瘟病，該結果表明，攜單一抗性基因的品種的稻瘟病抗性難以達到中抗的水平。而本研究中聚合Pikh、Pi-1和Pi-9(t)的品種——兩優7283和金泰優683在福建省區試和湖北省恩施州的區試中均表現中抗 (福建省和湖北省恩施州均為稻瘟病高發區)，由于兩優7283和金泰優683的母本272S和金泰A的抗性均表現為感病，輪回親本福恢673與宜香A配制的福建省晚稻遲熟組對照品種宜優673在區試中稻瘟病抗性表現為感病到高感，因此，可以判斷兩優7283和金泰優683的稻瘟病抗性是來自于父本福恢683 (Line 9)。該結果表明，聚合Pikh、Pi-1和Pi-9(t)稻瘟病抗性可以達到較高的抗性水平。

值得注意的是，利用目前水稻DNA指紋鑒定的48 對引物中對Line 9進行DNA指紋分析，發現RM119、RM190、RM224和RM481共4個標記與輪回親本有多態性，因此，福恢683 (Line 9)還無法直接代替原來的輪回親本應用于生產。因此，針對通過回交技術改良水稻輪回親本的個別性狀，要實現用改良的后代直接替代原來的感病親本應用于生產，在回交過程中需利用水稻DNA指紋分析所采用的48對引物對中選的株系進行背景選擇，這樣才有可能選出可以直接替代輪回親本的近等基因系應用于生產。由于本研究中Line 9 (福恢683) 是通過選育的近等基因系與宜香A配制的組合的雜種優勢最先篩選出來的，其他近等基因系與其他不同的不育系配制組合的表現還未系統進行分析，因此，下一步將利用這些近等基因系與不同的不育系進行大范圍的測配，進行產量、米質、抗性、生育期等綜合性狀分析，以期從中篩選出生產上有利用價值的株系進一步應用，研究結果也將為水稻分子標記輔助育種后代的篩選提供理論依據。