基于foldon介導的寡聚化以提高阿魏酸酯酶催化效率

張雷，雷林超，張光亞，李夏蘭

華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021

阿魏酸酯酶 (Feruloyl esterase E.C 3.1.1.73，FAE) 是羧酸酯酶的一個亞類，它能水解植物細胞壁中阿魏酸與多糖之間連接的酯鍵，釋放阿魏酸[1-2]。FAE可以協同木質纖維降解酶，如木聚糖酶、纖維素酶及木質素酶，破壞木質纖維的致密網狀結構，促進木質纖維降解[1-4]。但報道的FAE的催化性能有待提高，需對酶進行改造[5-7]。以定點突變和定向進化為代表的蛋白質工程技術已經成功地篩選了具有優化特性的酶，但這些方法在改造酶時仍存在困難，如突變體庫的建立和大量篩選工作[8]。而通過固定化或化學修飾，有時也能提高酶的性能，但存在酶在固定化過程中會引起酶失活、首次固定化成本高、與大分子底物反應較困難等缺點[9]。

蛋白質的結構決定其功能，可通過蛋白質工程對蛋白質進行改造以獲取蛋白質的新功能[10]。寡聚化是許多蛋白質自我聯合成寡聚體以獲得功能優勢的一種常用方式[11]。寡聚化能夠為目標酶提供多種功能優勢，如提高熱穩定性、pH 耐受性、蛋白質分子結構穩定性及催化性能等[12-14]。Foldon是來源于T4噬菌體纖維蛋白C-末端，由27個氨基酸 (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)組成，該結構域由3個相同亞基構成，每個亞基包含1個β-發夾結構[15]。通過基因融合，該結構域可與目標酶人工連接以改變其性質。幾種工程蛋白的熱力學穩定性，如短膠原纖維[16]、HIV1包膜糖蛋白[17]，均已通過foldon結構域的附著而得到增強。由COMP和foldon誘導形成的寡聚體通常可導致熱穩定性的提高[11,18]。Can等[13]將foldon與抗凍蛋白進行連接后形成寡聚化同型抗凍蛋白且提高了冰晶表面結合的抗凍蛋白濃度，使其活力顯著增加。本課題組在FAE的C-末端融合foldon，從而誘導酶自發形成三聚體，構成寡聚化阿魏酸酯酶，并對重組FAE的表達和其酶學性質進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌Escherichia coliDH5α購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；巴斯德畢赤酵母Pichia pastorisGS115、載體pPIC9K購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑和培養基

限制性內切酶 (SnaBⅠ、NotⅠ、SacⅠ)、T4 DNA連接酶購自美國Thermo Fisher公司；質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；標準蛋白質Marker (10-170 kDa)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白質快速銀染試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；阿魏酸甲酯購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產或進口分析純產品。MD培養基、YPD種子培養基、BMGY種子培養基、BMMY誘導培養基按美國Invitrogen公司的畢赤酵母操作表達手冊配制。

1.1.3 主要器材

納米激光粒度儀 (英國Malvern儀器公司)；200目銅網 (中科鏡儀有限公司)；透射電子顯微鏡 (日本電子株式社)；超高效液相色譜儀 (美國安捷倫科技有限公司)。

1.2 表達載體的構建

在 UniPort數據庫中篩選酶活較高的FAEO42807，該FAE是從黑曲霉Aspergillus nigerCBS120.49中分離得到的[1]。根據FAEO42807的氨基酸序列，以畢赤酵母標準密碼子優化設計FAE的基因序列，并在基因序列N端設計His標簽后，兩端引入SnaBⅠ、NotⅠ酶切位點，化學合成基因序列His-fae。用SnaBⅠ、NotⅠ分別雙酶切合成基因序列His-fae和質粒pPIC9K，膠回收雙酶切片段后用T4 DNA連接酶連接并轉化至E.coliDH5α感受態細胞。篩選出的陽性克隆子由Sangon測序，測序正確的重組質粒命名為pPIC9K/His-fae。另，將foldon基因與fae序列的C-末端直接融合，用相同方法構建重組質粒，命名為pPIC9K/Hisfae-foldon。基因與蛋白質示意如圖1所示。

1.3 重組FAE在畢赤酵母中的表達和純化

重組質粒用SacⅠ線性化，電轉化至P.pastorisGS115感受態后，涂布于MD平板上篩選重組子，取MD平板上生長良好的菌落用牙簽點種至YPD搖瓶中，過夜培養后提取其基因組DNA，利用通用引物5?AOX、3?AOX進行PCR鑒定。重組質粒的誘導表達參見畢赤酵母操作表達手冊。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，粗酶液用鎳層析柱進行純化，純化后用Bradford法測定蛋白質量濃度，SDS-PAGE分析純化后的酶液。

圖1 基因與蛋白質示意圖Fig.1 A schematic of gene and corresponding protein structures.Olig-FAE is a trimer structure formed by the monomer pre-olig-FAE while protein is expressed;multi-FAE contains both mon-FAE and olig-FAE.

1.4 重組FAE酶活力測定

高效液相色譜法測定FAE酶活力[19]。空白對照為煮沸失活的酶液。酶活力單位為在25 ℃、pH 6.0的條件下1 min生成1 μmol阿魏酸所需的酶量為1個酶活力單位。

1.5 重組FAE酶學性質的研究

以下實驗所用的酶液，mon-FAE 酶活力為(251±7.61) U/L，比活為 (0.36±0.011) U/mg，multi-FAE 酶 活 力 (441±12.7) U/L，比 活 為(1.63±0.045) U/mg。

1.5.1 最適反應溫度的測定

取250 μL酶液保溫5 min后，加入250 μL阿魏酸甲酯溶液 (由pH值為6.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液配制)，在40-65 ℃中反應10 min，測定重組FAE的酶活力。以所測的最高酶活力為100%，計算相對酶活。

1.5.2 溫度穩定性的測定

將酶液置于30-50 ℃下保溫12 h，每隔3 h取樣測定殘留酶活力，以保溫0 h所測定的酶活力為100%，計算相對酶活。

1.5.3 最適反應pH值的測定

取250 μL酶液于50 ℃保溫5 min后，加入250 μL 的阿魏酸甲酯溶液 (0.2 mol/L 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液調節pH值在3.0-8.0之間)，50 ℃下反應10 min，測定重組FAE的酶活力。以所測的最高酶活力為100%，計算相對酶活。

1.5.4 pH值穩定性的測定

將酶液置于0.2 mol/L、pH值為3.0-8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，50 ℃保溫2 h，取250 μL保溫酶液，向其加入250 μL阿魏酸甲酯溶液，50 ℃下反應10 min，測定重組FAE殘留酶活力，以各pH值的0 h酶活力為100%，計算相對酶活。

1.5.5 金屬離子對重組FAE酶活力的影響

將酶液與含有10 mmol/L的各種金屬離子(Na+，K+，Mn2+，Fe2+，Cu2+，Mg2+，Ca2+，Zn2+)的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液 (pH 6.0) 混合，于50 ℃保溫2 h，測定殘留酶活，以不添加金屬離子所測得的酶活力為100%，計算相對酶活。

1.5.6 動力學常數的測定

米氏常數的測定：取8支試管，每管都加好200 g/L阿魏酸酯甲酯溶液和0.2 mol/L、pH 6.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，在25 ℃下預熱3 min，用同一管酶液依次加樣，依次在酶作用1-30 min時測定酶活力，然后算出酶活力與反應時間的比值，在一定時間內比值保持穩定，則在此時間內酶作用為一級反應，此時間即可確定為測Km值和Vmax的反應時間。用不同濃度的底物，在0.2 mol/L、pH 6.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖體系中，25 ℃下反應一定時間，測定酶活，計算相應的反應速度，利用米氏方程雙倒數法求得Km值及Vmax。

1.6 重組FAE蛋白粒徑的測定

重組FAE的粒徑大小由納米激光粒度儀測定[20]。配置的參數：散射角173°、HeNe激光器633 nm、輸出功率10 mW，使用內置溫度將樣品控制在特定溫度 (25-65 ℃)，并在進行測定之前將樣品在相應溫度下穩定5 min；粒徑大小為樣品顆粒大小平均值。

1.7 重組FAE透射電子顯微鏡分析

將5 μL適量濃度蛋白質樣品滴加到碳支持膜涂覆的200目銅網格上并溫育5 min，過量的蛋白質樣品用濾紙進行印記干燥。網格用兩個20 μL水洗滌并印記干燥，25 μL 2%乙酸鈾酰滴30 s，印記干燥后使用透射電子顯微鏡在100 kV下觀察樣品，并使用CCD照相機記錄電子顯微照片。

2 結果與分析

2.1 重組FAE轉化子的PCR鑒定與篩選

分別以pPIC9K/His-fae和pPIC9K/His-faefoldon的基因組為模板，用5?AOX1和3?AOX1引物進行PCR驗證，PCR產物用1%的凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。以pPIC9K/His-fae轉化子基因組為模板進行PCR，泳道1、2、4、6-8得到一條約800 bp的His-fae片段，顯示目的基因His-fae已經成功整合到這些轉化子基因組中，以pPIC9K/His-fae-foldon轉化子基因組為模板進行PCR，泳道11、15-18得到一條約900 bp的His-fae-foldon片段，顯示目的基因His-fae-foldon已經成功整合到這些轉化子基因組中。

2.2 重組FAE的表達和純化

挑取上述陽性轉化子，按照1.3進行培養和誘導表達，測定其酶活力，挑選實驗中產酶活力最高的轉化子。取其發酵上清液純化后進行SDS-PAGE分析。對于pPCI9K/His-fae，如圖3A所示，pPCI9K/His-fae發酵上清液純化后，40 kDa處得到一條清晰條帶，而且幾乎沒有雜條帶，初步說明mon-FAE得到成功表達。圖3A顯示mon-FAE的表觀相對分子質量明顯大于其理論值(29.97 kDa)，主要原因是FAE蛋白序列的N端有一個糖基化位點，而畢赤酵母表達外源蛋白時，會對其進行糖基化修飾，從而使相對分子質量增大[21]。對于pPCI9K/His-fae-foldon，如圖3B所示，pPCI9K/His-fae-foldon發酵上清液純化后，SDS-PAGE結果顯示的pre-olig-FAE表觀相對分子質量明顯大于其理論值 (33.04 kDa)；olig-FAE表觀相對分子質量明顯大于其理論值99.12 kDa，其原因與mon-FAE表觀分子質量大于其理論值原因相同。且理論上，pPCI9K/His-fae-foldon上清發酵液應僅在三聚體位置即110 kDa處出現一條條帶，而pPCI9K-/His-fae-foldon發酵上清液在單體 (pre-olig-FAE) 45 kDa處和三聚體 (olig-FAE)110 kDa處均出現條帶，原因可能是由于空間位阻效應，導致部分pre-olig-FAE未寡聚化，仍以pre-olig-FAE單體存在。

圖2 重組FAE轉化子的PCR電泳圖Fig.2 Electrophoresis map of the PCR analysis of recombinant FAE.Lane M：marker;lane 1-8：pPIC9K/His-fae transformants as template;lane 9：pPIC9K/His-fae plasmid as template;lane 10：sterile water as control;lane 11-18：pPIC9K/His-fae-foldon transformants as template;lane 19：pPIC9K/His-fae-foldon plasmid as template.

圖3 SDS-PAGE分析產物表達Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant FAE.(A)pPCI9K/His-fae.(B) pPCI9K/His-fae-foldon.

比較了mon-FAE和multi-FAE的酶活力及比活性 (表1)，發現multi-FAE的酶活力和比活力相比mon-FAE有小幅度提高。這些結果表明foldon在FAE的C-末端融合有利于提高FAE的酶活力及比活力。

2.3 FAE寡聚化過程的研究

文獻報道，foldon結構域與蛋白進行融合表達時，寡聚化的蛋白極易受到溫度的影響，并在40 ℃開始發生少量解聚，當溫度上升至60 ℃以上時，寡聚化結構蛋白完全解聚，當溫度介于二者之間時，寡聚蛋白部分解聚，兩種蛋白同時存在[22]，本課題組也證明了此結果。在本實驗過程中，為考察olig-FAE在不同溫度條件下的解聚情況，分別將目標蛋白與蛋白上樣緩沖液按5∶1 (V/V)混合并在25 ℃、40 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、100 ℃條件下分別水浴5 min后進行SDS-PAGE分析，結果如圖4所示。結果表明環境溫度為25 ℃時，45 kDa處的蛋白條帶為由于空間位阻作用未形成寡聚化結構的pre-olig-FAE，且蛋白條帶較細；110 kDa處為形成寡聚化結構的olig-FAE，該溫度下，olig-FAE還未發生解聚。當溫度為40 ℃時，45 kDa處的蛋白條帶pre-olig-FAE相比于25 ℃時的蛋白條帶較粗，說明olig-FAE開始發生部分解聚，且隨著溫度的升高，45 kDa處的蛋白條帶pre-olig-FAE逐漸加粗，說明olig-FAE解聚量不斷增加。在60 ℃及以上溫度時110 kDa處的蛋白條帶olig-FAE已完全消失，SDS-PAGE顯示僅有一條45 kDa的條帶，說明寡聚化酶完全解聚。但實驗過程發現，解聚過程中在45 kDa單體位置有2條非常靠近的條帶 (圖4)，因此，將經鎳柱純化后的濃度為1 mg/mL的酶液送樣至上海中科新生命生物科技有限公司進行MOTIF/TOF質譜分析，結果顯示僅在425 174.0出現一個峰，故判定圖4單體位置的兩條非常靠近的條帶為同一物質。

表1 重組酶的酶活性測定Table 1 Enzyme activity of the recombinant FAE

圖4 olig-FAE隨溫度變化聚集情況SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE of olig-FAE aggregation as temperature change.M：protein molecular weight marker;lane 1：25 °C;lane 2：40 °C;lane 3：55 °C;lane 4：60 °C;lane 5：65 °C;lane 6：70 °C;lane 7：100 °C.

使用動態光散射 (DLS) 對不同溫度時重組FAE的粒徑進行了測定，結果顯示在25 ℃時分別在6.57 d.nm處以及52.74 d.nm處有2個峰，且隨溫度的升高6.57 d.nm處的粒徑出峰值變化不大，范圍在6.5-8.5 d.nm之間，而52.74 d.nm處的粒徑出峰值會隨著溫度的變化而逐漸變小，由于寡聚化結構foldon隨溫度的升高而逐漸解聚，平均粒徑逐漸變小，所以判斷該處為olig-FAE出峰處，olig-FAE隨溫度變化的粒徑結果見圖5。從圖中可以看出，隨著溫度升高，olig-FAE的平均粒徑逐漸變小，且溫度升高至65 ℃時，olig-FAE的平均粒徑由25 ℃時的52.74 d.nm降低為10.62 d.nm，與mon-FAE所測得的平均粒徑 (9.54±2.12) d.nm相近，證明65 ℃時olig-FAE已全部解聚為單體結構。

本實驗還采用透射電子顯微鏡圖像進一步探究在25 ℃時olig-FAE的蛋白結構性質，為了便于觀察olig-FAE的蛋白結構，將樣品稀釋至0.15 mg/mL，電鏡結果如圖6所示。圖6中顯示在負染色液包裹范圍中有接近球形形態的顆粒聚集在一起，形成寡聚化結構。

2.4 重組FAE的酶學性質

2.4.1 最適溫度及溫度穩定性的測定

探究在40-65 ℃時酶反應的最適溫度，結果如圖7所示。由圖7可知，mon-FAE與multi-FAE最適溫度均為50 ℃，且50 ℃之前，兩者的酶活均較高，相對酶活都在90%以上。超過50 ℃后，兩者的酶活力下降均較快，可能是隨著溫度的升高，酶出現失活現象。

圖5 溫度對olig-FAE粒徑的影響Fig.5 Effect of temperature on the particle size of olig-FAE.

圖6 Olig-FAE的TEM圖像Fig.6 TEM image of olig-FAE.

圖7 重組FAE的最適溫度Fig.7 Effect of temperature on the activity of recombinant FAE.

將重組FAE在30-55 ℃保溫0、3、6、9、12 h后，測定其殘余酶活，結果如圖8所示。mon-FAE及multi-FAE在30-55 ℃溫度下，隨著保溫時間的延長，酶活力均逐漸下降。30-40 ℃保溫12 h后，酶活力為初始酶的70%左右，且multi-FAE與mon-FAE酶活力相比較高一些，在40 ℃以后，multi-FAE及mon-FAE的酶活力均下降較快，且在50 ℃保溫3 h后，基本喪失酶活。

圖8 重組FAE的溫度穩定性Fig.8 Effect of temperature on the stability of recombinant FAE.(A) mon-FAE.(B) multi-FAE.

2.4.2 最適pH及pH穩定性的測定

重組酶的最適pH結果如圖9所示。由圖9可知，mon-FAE的最適pH值為6.0；multi-FAE的最適pH值為5.0。重組酶的pH值穩定性結果如圖10所示。由圖10可知，pH值為3.0-6.0時，隨著pH增大，mon-FAE的穩定性隨之增大，pH值為6.0時，mon-FAE的pH穩定性最高，pH值大于6.0時，mon-FAE穩定性逐漸下降；pH值為3.0-5.0時，隨著pH增大，multi-FAE的穩定性隨之增大，pH值為5.0時，multi-FAE的pH穩定性最高，pH值大于5.0時，multi-FAE的穩定性逐漸下降。multi-FAE對pH值較敏感，這可能是因為pH值影響了FAE的寡聚化程度，從而影響了酶的穩定性[23]。

圖9 重組FAE的最適pHFig.9 Effect of pH value on the activity of recombinant FAE.

圖10 重組FAE的pH穩定性Fig.10 Effect of pH value on the stability of recombinant FAE.

2.4.3 金屬離子對重組FAE的影響

金屬離子對重組酶活力的影響見表2，對于mon-FAE，Mn2+、Mg2+有促進作用，K+、Ca2+、Fe3+、Cu2+對其有一定的抑制作用，而Zn2+對其有顯著的抑制作用。對于multi-FAE，Mn2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Cu2+對其有促進作用，K+對其有一定的抑制作用。

表2 金屬離子對重組FAE的影響Table 2 Influences of metal ions chemicals on the activity of the FAE

2.4.4 動力學常數的測定

由于olig-FAE隨溫度升高會逐漸解聚為pre-olig-FAE，故在25 ℃測定動力學常數，見表3。其中multi-FAE的Km(1.03±0.02) 與mon-FAE(4.55±0.07) 相比較小，說明multi-FAE的底物親和力較mon-FAE有所提高，且提高倍數為3.42倍；multi-FAE的kcat/Km(3.94±1.12) 與mon-FAE(0.46±0.063) 相比較大，說明multi-FAE的催化效率較mon-FAE有明顯提高，且提高倍數為7.57倍；同時，multi-FAE的kcat、Vmax較mon-FAE均有所提高。其他研究人員的報道也存在類似的結果，例如，Yang等[24]將寡肽與堿性淀粉酶的N-末端融合，AmyK-p1的比活性和催化常數 (kcat) 分別增加4.1倍和3.5倍，他們認為提高催化效率和比活性的主要原因是由肽的活性部位周圍誘導更大的靈活性，同時寡聚化酶與底物的“鄰近效應”，使酶的活性中心部位更集中，其底物濃度也大大高于溶液中的底物濃度，從而提高其催化效率。

表3 重組FAE動力學常數的測定Table 3 Determination of kinetic parameters of recombinant FAE

3 討論

阿魏酸酯酶可在工農業、食品制造、醫藥等領域都發揮巨大的作用。為了商業應用，已有很多提高FAE酶催化性能的報道，并與本文研究結果相比，結果見表4。

文獻[25]報道應用DNA改組策略和定向突變后，催化效率提高12.8倍。文獻[26]報道應用PoPMuSiC算法預測氨基酸取代的折疊自由能變化，通過定點誘變取代4個氨基酸，雙突變體D93G/S187F顯示出kcat/Km增加了9倍。文獻[28]報道進行兩輪隨機誘變獲得熱穩定突變體M6，M6的kcat/Km值提高1.9倍。文獻[29]報道使用MODIP和DbD兩種計算工具來預測蛋白質中可能存在的用于熱穩定性改善的二硫鍵，引入額外的二硫橋對FAE實施改造，并使用分子動力學模擬來設計額外的二硫橋，選擇一個殘基對A126-N152突變為半胱氨酸。突變型AuFaeA的最適溫度提高了6 ℃，半衰期在55 ℃和60 ℃分別提高12.5倍和10倍，催化效率 (kcat/Km) 與野生型AuFaeA相似。文獻[30]報道利用介孔二氧化硅材料作為固定支持物，通過物理吸附將FAE固定在介孔二氧化硅上，并通過改變支持孔徑、固定緩沖液和pH來優化固定條件，實現最大負載和最大活性，在10次酯交換反應后，保留了其20%以上的活性，Km不受固定化的影響，但是kcat減少了10倍。值得一提的是本文報道的基于foldon引導的寡聚化FAE 25 ℃半衰期提高55.5%，Km減小了3.42倍，催化效率提高了7.57倍。文獻中這些方法雖在不同程度上提高了酶活性，但是定點誘變需要對酶結構和功能之間的關系有清楚的了解[32]，定向進化需要一種簡單而有效的高通量篩選方法[33]，化學修飾可能通過改變活性位點中的活性構象或必需殘基而引起酶活性的意外喪失[34]。

表4 分子工程改造對FAE性質的影響Table 4 The effect of molecular engineering on the properties of FAE

本文的方法條件溫和，操作簡單，并不需要從突變文庫篩選目標酶。與mon-FAE相比，multi-FAE底物親和力以及催化效率顯著提高，這可能是由于寡聚化結構域foldon具有高固定濃度從而減少焓相互作用，加速了催化效率[16]，且寡聚化酶分子的局部濃度增加，也加速了活性位點和底物的接觸[35]。但是很遺憾，因為空間位阻作用，pre-olig-FAE未完全形成寡聚化，pre-olig-FAE與olig-FAE中都含有His標簽，且兩者的相對分子質量相差僅僅66 kDa，表達量也有限，本實驗室目前還無法將olig-FAE純化，但multi-FAE因含有寡聚化的olig-FAE，與mon-FAE相比，酶催化效率已有很大的提高。本課題組前期也將foldon結構域與分子量較小且結構簡單的木聚糖酶和地衣多糖酶分別在原核表達系統進行融合表達，酶的kcat/Km分別提高了4.2倍和3.0倍[36]。此次，本課題組將foldon結構域與分子量較大且結構相對復雜的FAE在真核表達系統融合表達，結果表明，目標酶催化效率有很大提高，進一步表明該方法有望成為一個提高酶催化性能的通用且高效的方法，其操作簡單，無需事先詳細了解酶的3D結構，具有良好的應用前景，值得深入研究。

4 結論

mon-FAE以及pre-olig-FAE在P.pastorisGS115中成功表達，且含有由foldon引發寡聚化FAE的multi-FAE較mon-FAE的比活、底物親和力以及催化效率顯著提高。與mon-FAE相比，multi-FAE的最適溫度及溫度穩定性未受到太大影響。綜上所述，foldon結構域可提高FAE催化性能，是一種改造酶的簡單高效方法。