KaiA調控藍藻生物鐘的分子機制研究進展

李金奎，曹春雨，喻玲玲，劉森

1 三峽大學 醫學院 腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002

2 湖北工業大學 教育部發酵工程重點實驗室/工業微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068

晝夜節律現象廣泛存在于生物體中，即使簡單的原核生物藍藻也表現出晝夜節律行為。生物體晝夜節律受到體內生物鐘的調控，藍藻生物鐘是目前已知的最簡單的生物鐘，也是生物鐘分子機制研究中最重要的模型之一。藍藻生物鐘系統主要包括輸入途徑、核心振蕩器和輸出途徑3部分。核心振蕩器是藍藻生物鐘的關鍵部分，它不同于DNA轉錄和RNA翻譯所形成的負反饋振蕩器，屬于翻譯后振蕩器[1]。更為重要的是，藍藻生物鐘的核心振蕩器是迄今為止唯一能僅通過將其組成蛋白 (KaiA、KaiB、KaiC三種蛋白) 混合在適當的緩沖溶液中即可實現體外重建的生物振蕩器。因此，藍藻生物鐘核心振蕩器一直是生物鐘研究的熱點，而解析其組成蛋白KaiA、KaiB、KaiC的結構和闡明其分子機制具有重要意義。

文中圍繞藍藻生物鐘核心振蕩器及其組成蛋白的結構和功能特點，針對時鐘蛋白KaiA調節KaiC的酶活性、介導核心振蕩器的時相重置、與CikA競爭KaiB的結合位點等方面對近年來的研究進展進行了綜述 (圖1)。

1 藍藻生物鐘核心振蕩器簡介

生物鐘的分子機制一直以來都是研究者們感興趣的內容。以往的研究認為，轉錄/翻譯反饋環路(Transcriptional/translational feedback loop，TTFL)是唯一的生物節律產生機制[2]。但在2005年，Kondo等首次證明在藍藻的生物鐘體系中存在獨立于基因轉錄的生物節律起搏器[3]——翻譯后振蕩器 (Post-translational oscillation，PTO)[4-5]。后期研究表明，藍藻的生物鐘由PTO和TTFL兩部分組成，PTO是核心起搏器，TTFL則負責生物鐘的輸入和輸出途徑。PTO 和TTFL共同調節藍藻的生物鐘系統[6]。

圖1 KaiA調控藍藻生物鐘的分子機制總體圖示Fig.1 Overall diagram of the molecular mechanism that KaiA regulation cyanobacterial clock.

藍藻生物鐘PTO部分的核心，由一簇稱為kaiABC的基因所編碼的生物鐘蛋白組成。該基因簇包括kaiA、kaiB和kaiC三個基因[7]。kaiABC基因簇所編碼的蛋白KaiA、KaiB和KaiC是藍藻生物鐘核心振蕩器的主要組成成分。藍藻生物鐘核心振蕩器產生晝夜節律的計時機制表現在2個方面：基因簇轉錄水平呈高低的節律性變化；KaiA和KaiB共同作用使KaiC蛋白的磷酸化水平表現出節律性變化[8]。

2 藍藻生物鐘核心振蕩器組成蛋白的結構和功能特點

藍藻生物鐘核心振蕩器的組成蛋白KaiA、KaiB、KaiC之間存在多種相互作用，從而控制KaiC的磷酸化水平呈現節律性振蕩。Kai蛋白中的任意兩種均可以相互作用，任何Kai蛋白的缺失將使核心振蕩器喪失功能，3種Kai蛋白同時存在時核心振蕩器才能正常運行[9]。在此基礎上，研究人員對KaiA、KaiB和KaiC的空間結構及功能特點進行了大量研究。

2.1 核心振蕩器組成蛋白KaiC的結構和功能特點

KaiC的主要形式為6個單體組成的同源六聚體結構。每個KaiC單體具有2個結構域，分別是C端的CII結構域和N端的CI結構域。KaiC蛋白同時兼備自激酶 (Autokinase) 和自磷酸酶(Autophosphatase) 活性。激酶可以使KaiC自身亞基相互磷酸化，磷酸酶則推動KaiC去磷酸化。激酶和磷酸酶同時存在是KaiC發生磷酸化-去磷酸化周期性變化的基礎[10]。KaiC的CII結構域上存在2個磷酸化位點，分別是431位的絲氨酸殘基和432位的蘇氨酸殘基。因此，每個KaiC單體就具備4種可能的磷酸化狀態，且能夠按照順序磷酸化[11]。

2.2 核心振蕩器組成蛋白KaiB的結構和功能特點

KaiB蛋白有單體、二聚體、四聚體甚至多聚體等多種狀態。在整個振蕩周期中，KaiB蛋白會根據KaiC蛋白磷酸化狀態的改變形成不同的聚合體。KaiB蛋白在這些不同的聚合體之間轉換狀態，以此來適應KaiC的狀態進而與KaiC結合[12]。最近的研究發現，KaiB蛋白會在2個不同的三維折疊之間轉換，從而提供時間延遲并使該振蕩器的時相與地球旋轉的時相相匹配[13]。

2.3 核心振蕩器組成蛋白KaiA的結構和功能特點

KaiA蛋白有3個功能結構域：放大振蕩幅度的N端結構域，產生節律性振蕩的C端結構域，以及將N端和C端連接的中間結構域。

KaiA的N端結構域一般指第1-135位氨基酸殘基。N端一半的結構展現出與傳統信號接收結構域類似的折疊。但是與傳統信號接收結構域相比，KaiA的N端結構域缺乏磷酰基轉移反應所需的保守Asp殘基，所以KaiA的N端結構域被認為是偽受體結構域[14]。

KaiA的C端結構域 (第180-284位氨基酸殘基) 高度保守。該結構域由4個α螺旋組成，負責KaiA的同源二聚化，介導KaiA與KaiC相互作用，促進KaiC的磷酸化[15]。

連接N端和C端的中間結構域，包含第136-179位的氨基酸殘基。最近的研究表明中間結構域會影響KaiA的活性狀態[16]。

3 核心振蕩器組成蛋白KaiA的調控機制

對于Kai蛋白相互作用的研究表明，KaiA刺激KaiC發生磷酸化，而KaiB的主要作用是結合磷酸化狀態的KaiC，通過阻止KaiA與KaiC的作用，從而促進KaiC去磷酸化[9]。在核心振蕩器的組成蛋白中，KaiC能發生磷酸化水平的變化，所以KaiC是振蕩器的核心。在整個振蕩周期中，KaiA直接作用于KaiC來調控KaiC的磷酸化狀態，而KaiB主要是通過影響KaiA來間接調控KaiC的磷酸化狀態[17]。因此，較多的研究集中于闡明KaiA對核心振蕩器的調控機制。

3.1 KaiA通過調節KaiC多種酶的活性影響核心振蕩器節律

KaiC兼具激酶、磷酸酶以及ATP酶等多種酶活性，并通過這些酶活性的共同作用調控核心振蕩器的節律[18]。核心振蕩器的節律表現在KaiC磷酸化水平的高低變化。通過體外重建實驗和復合物結構解析，研究人員發現KaiA通過C末端與KaiC直接作用，這種相互作用能調節KaiC多種酶的活性，進而改變KaiC磷酸化水平的高低，從而影響核心振蕩器的節律[19]。

3.1.1 KaiA調節KaiC激酶和磷酸酶活性影響核心振蕩器節律的產生

KaiC的C末端488-497殘基形成的A-Loop區 (簡稱A環) 有埋藏和暴露2種狀態。A環的埋藏和暴露狀態決定了KaiC自磷酸酶和自激酶的活性水平，進而影響KaiC的磷酸化水平[20]。當A環處于埋藏狀態，KaiC自磷酸酶活性較高；當A環暴露時，KaiC自激酶活性占優勢。在解析出的KaiC晶體結構中，A環處于埋藏狀態，此時ATP的γ-磷酸基團與磷酸化位點的距離較遠，KaiC難以發生磷酸化[21]。所以，KaiC自身的磷酸酶較激酶活性占優勢，KaiC本身具有低水平的自激酶活性。

當KaiA、KaiC共同存在時，KaiA通過C末端直接結合KaiC的A環并穩定A環的暴露狀態。A環的暴露使ATP更靠近磷酸化位點，KaiC自激酶的活性增加，伴隨KaiC磷酸化水平升高。當A環無法穩定在暴露狀態，ATP的γ-磷酸基團在空間上將遠離磷酸化位點S431和T432，KaiC自磷酸酶活性占據優勢，伴隨KaiC磷酸化水平的降低。KaiA的C末端與KaiC的C末端通過結合和解離作用來決定KaiC磷酸酶和自激酶活性的傾向，產生KaiC磷酸化水平的高低變化，從而產生振蕩的節律 (圖2)[22]。通過實時量化KaiA與KaiC在亞秒級時間尺度上的相互作用后發現，KaiA對KaiC激酶的刺激作用為瞬時動態過程，且KaiC的磷酸化對KaiA的結合存在著反饋機制。隨著KaiC磷酸化水平的升高，KaiA對KaiC激酶的刺激作用逐漸減弱。通過這種瞬時動態作用和反饋機制，可以穩定振蕩體系不被體內的其他代謝活動所干擾[23]。

上述過程中，KaiB不直接與A環相互作用，也不影響KaiC自身磷酸化。相反，KaiB通過使KaiA失活而起作用，從而使高磷酸化狀態KaiC的磷酸酶活性占據優勢，發生去磷酸化[24]。

3.1.2 KaiA調節KaiC的ATP酶活性影響核心振蕩器的周期

從結構上分析，KaiC的N和C末端結構域均含有典型的Walker’s基序。該基序是一種保守的氨基酸序列，廣泛存在于各種GTP結合蛋白中，可以結合ATP[25]。研究表明，KaiC具有弱的ATP酶活性，并且ATP酶的活性會發生節律性波動，更為重要的是，KaiC的ATP酶活性對周期的形成具有重要意義[26-27]。

研究表明，KaiC的去磷酸化通過磷酸化反應的逆轉而發生，振蕩節律由KaiC可逆自磷酸化反應的周期性變化產生[28]。當KaiC單獨存在時，其ATP酶活性保持恒定。當KaiA、KaiC共同存在時，KaiA刺激KaiC的ATP酶活性升高，加速KaiC結合的ADP與外源ATP交換來促進正向反應。而KaiB會抑制KaiA的作用致使KaiC的ATP酶活性降低，進而保留KaiC結合的ADP，從而促進逆反應。因為KaiA與KaiC的A環相互作用，而A環靠近CII結構域的ATP酶活性位點，所以KaiA可能通過調節A環的狀態來影響ATP酶的活性，進而決定可逆自磷酸化反應的方向[29]。

圖2 KaiA通過影響KaiC的A-Loop調節KaiC的酶活性Fig.2 KaiA regulates the enzymatic activities of KaiC by affecting the A-Loop.

綜上所述，KaiA通過調節KaiC的ATP酶、激酶和磷酸酶活性來影響核心振蕩器的節律。

3.2 KaiA通過活性狀態的轉換調控核心振蕩器的時相

雖然單個Kai蛋白的結構和功能被廣泛研究，但是Kai蛋白之間動態作用的機制仍存在眾多疑問。例如，KaiA與未磷酸化的KaiC結合的分子細節，以及KaiC由磷酸化狀態轉變為去磷酸化狀態這一動態過程中KaiA作用的分子機制均不清楚。近幾年來的研究在KaiA與KaiC之間的動態相互作用方面取得了一些新的進展。

3.2.1 KaiA在Kai復合物中轉變活性狀態

研究表明，在整個振蕩周期中，KaiA的活性狀態會發生改變[30]。KaiC未發生磷化時，KaiA處于活性狀態，通過C末端結合KaiC刺激KaiC發生磷酸化[15]。隨著KaiC磷酸化水平的升高，KaiA的刺激能力減弱，當磷酸化的KaiC與KaiB結合時，KaiA對KaiC的刺激能力進一步減弱[31]。KaiA、KaiB和KaiC在相互作用形成KaiABC三元復合物后，KaiA轉變為非活性狀態，并且非活性狀態KaiA的出現啟動了KaiC的去磷酸化。

在振蕩周期中，Kai蛋白以各種組合發生相互作用，重復裝配和分解形成同源和異源多聚Kai復合物。在磷酸化開始階段，KaiA迅速并反復與KaiC接觸促進KaiC磷酸化，這種反復作用形成了動態的KaiAC復合物，此時KaiA處于活性狀態。當高磷酸化水平的KaiC出現后，KaiC結合KaiB。KaiC與KaiB的結合則使KaiA逐漸失去活性狀態，KaiC的去磷酸化階段開始啟動[24]。當穩定的KaiABC三元復合物形成時，該復合物會阻止KaiA與KaiC的反復作用，KaiA呈現為非活性狀態[32]。當KaiC的磷酸化水平回降時，KaiB與KaiC分離，KaiA也被分離出來并恢復活性狀態(圖3)[30]。在體外振蕩期間，KaiA有節律性地在不同的復合物中轉變活性狀態[33]。

圖3 KaiA在活性態與非活性態之間轉換進而調控核心振蕩器的時相Fig.3 KaiA converts between active and inactive states to regulate the phase of the core oscillator.

3.2.2 活性態KaiA與KaiC形成動態變化的結合構象介導KaiC的磷酸化

研究者們在KaiA與未磷酸化的KaiC結合介導KaiC發生磷酸化的分子機制上存在著不同的觀點。KaiC的C末端氨基酸序列無固定構象，是一段無序區域，而KaiA通過其C末端結構域與KaiC的該無序區域結合。電子顯微鏡分析KaiAC復合物的結果顯示：KaiA與KaiC的結合可以是“tethered”模型或者是“engaged”模型。在tethered模型中，KaiA被KaiC的C末端捕獲，但沒有與KaiC的CII結構域的圓頂結構直接接觸。在engaged模型中，KaiA接近并與KaiC-CII的圓頂結構直接接觸[34]。通過NMR測定的KaiAC復合物的結構顯示：KaiC的C末端衍生肽采用無規則卷曲構象結合在KaiA同源二聚體的C末端結構域之間的凹陷空間中[35]。通過X射線測定的KaiAC復合物結構顯示：KaiC的C末端衍生肽采用α螺旋構象與KaiA結合[15]。幾種技術測定的結構完全不同，無法確定KaiA-KaiC相互作用的正確模型。

本課題組利用“second-site suppressor”策略來研究KaiA和KaiC的相互作用機制，使用蛋白質序列分析以及誘變研究的手段，將所得數據與之前所報道的數據相結合，并建立了數學模型解釋。本課題組的研究提出，KaiA和KaiC的固有無序尾部在結合過程中通過構象選擇和誘導擬合經歷顯著的結構變化，兩者間的作用為動態過程，形成不同的結合構象[4]。這包含了之前所用技術測定的結合構象。因為KaiC的C末端尾部是一個本質上無序區域，它可以采用不同的構象與蛋白質配偶體結合。所以，KaiC的C末端尾部在與KaiA作用時具有不同的構象是合理的。NMR結構中測定的構象可能是正在進行“蛋白質捕獲”這一過程，X射線測定的折疊構象可能是真正發揮作用的結構。通過這種方式，KaiA與KaiC的相互作用可以被精細調節，并具有高特異性。

3.2.3 KaiA通過自我構象抑制切換活性狀態介導KaiC的去磷酸化

近兩年的研究也報道了KaiBC復合物使KaiA失活的具體細節。KaiA的中間結構域曾被認為起放大振幅和作為KaiB結合位點的作用[36-37]，而本課題組通過設計不同形式的KaiA蛋白，并結合分子動力學分析，提出KaiA的中間結構域會發生不對稱的構象變化，并使KaiA在活性和非活性形式之間發生可逆性轉換[38]。在KaiC磷酸化期間，KaiA二聚體的C末端結構域使用對稱位點結合KaiC的CII結構域的C末端序列。KaiC磷酸化水平的升高促使KaiBC復合物的形成，進而和KaiA形成KaiABC復合物。晶體結構的數據指出，KaiA二聚體在與KaiBC復合物結合時經歷較大的構象變化，KaiA中間結構域的β折疊發生旋轉，并與KaiB的一個β折疊形成反向平行的β折疊結構。同時，KaiA中間結構域的α螺旋向下旋轉到自身二聚體界面上的KaiC結合位點，從而阻斷KaiC蛋白CII結構域的C末端多肽與KaiA的結合[30]。因此，通過遠程變構機制，KaiA上的2個KaiC結合位點在自我抑制構象中被有效阻斷，伴隨KaiC去磷酸化階段的啟動。

本課題組的研究結果與晶體結構及核磁共振的數據共同表明，KaiA處于活性和非活性構象的動態平衡中，KaiB會誘導KaiA的自我構象抑制。因此，KaiA通過自我構象抑制的方式切換活性狀態從而調控振蕩器的時相。

3.3 KaiA與CikA競爭KaiB同一結合位點影響核心振蕩器的信號傳輸

3.3.1 信號傳輸蛋白CikA的結構和功能

CikA蛋白在核心振蕩器的信號輸入和輸出途徑中都發揮重要作用，它與信號輸出蛋白SasA屬于同一蛋白激酶家族，是組氨酸蛋白激酶和自磷酸化酶[39]。CikA具有3個結構域：GAF結構域，組氨酸蛋白激酶 (HPK) 結構域和偽受體(PSR) 結構域。CikA的N端結構域與信號接受結構域類似，提示該結構域可能起接收信號的作用。CikA的C端PsR結構域會封閉HPK結構域上的磷酸化位點，從而阻礙了CikA發生磷酸化。當PsR結構域與S-KaiC (KaiC僅在S431位點磷酸化)相互作用時，HPK結構域的限制將被解除，CikA發生磷酸化。磷酸化的CikA充當RpaA的磷酸酶進而影響基因的節律性表達[40]。

3.3.2 KaiA與CikA競爭結合KaiBC復合物的相同位點

CikA可以感知細胞的氧化還原狀態，并且通過與KaiABC蛋白質復合物的結合，重置基于KaiABC的晝夜節律振蕩器[41]。KaiB與KaiC的混合物可以激活使RpaA去磷酸化的CikA的磷酸酶活性，間接說明了KaiBC復合物可以與CikA結合[13]。晶體結構的數據證實了CikA的PsR接收域直接與 KaiBfs-KaiC 復合物相互作用(KaiBfs為折疊轉換態的KaiB)。KaiBfs-KaiC復合物也會與KaiA相互作用，將KaiA穩定在自我抑制構象，鎖定KaiA處于非活性的狀態。在形成的PsR-KaiB-KaiC三元復合物中，CikA的PsR結構域的β2折疊和KaiBfs的β2折疊相互平行作用。在KaiA-KaiB-KaiC三元復合物中，KaiBfs使用相同的β2折疊來結合KaiA的β2折疊。突變KaiBfs的β2鏈中的關鍵殘基，同時降低了其與KaiA及PsR結構域的相互作用[30]。

3.3.3 KaiA與CikA的競爭影響振蕩器信號的傳輸

如上所述，KaiA和CikA的PsR結構域結合在KaiB的相同結合位點。KaiBfs-KaiC會實現對KaiA的滅活，進而啟動KaiC的去磷酸化。CikA通過與KaiA競爭KaiB上的同一位點來激活使RpaA去磷酸化的磷酸酶活性。通過這種競爭機制，可以將KaiC去磷酸化的信息傳輸到下游。

KaiA和CikA的N端在結構上均屬于類信號轉導蛋白，在振蕩器的輸入途徑中，兩者的N端結構域都對細胞的氧化還原狀態敏感[42]。而在輸出途徑中，KaiA和CikA競爭結合同一位點，KaiB和SasA也是如此。SasA和CikA又會在輸出途徑中共同調節RpaA的活性進而影響下游的節律信號。因此，信號輸入、中心振蕩器和信號輸出形成緊密耦合。

4 總結與展望

生物鐘的分子機制被廣泛研究，目前可將其分為TTFL和PTO這2種。相比TTFL，PTO更為廣泛存在，在古菌、細菌、真核生物 (包括人)中都有發現[43]。因此，PTO機制可能是物種間更為保守的生物振蕩機制。最早確認的PTO，是藍藻中基于KaiA、KaiB、KaiC三個蛋白質的生物鐘體系[3]。KaiABC體系并不是廣泛存在跨物種保守的PTO。相比KaiABC，以過氧化物氧還蛋白為核心的氧化-還原節律性循環組成的PTO更為廣泛和保守存在[44]。但是，KaiABC是目前唯一能在體外重現的PTO體系，并且生物鐘系統的自我維持性、周期性及溫度補償性都可以在KaiABC中重現。所以，對生物鐘PTO機制的研究中，藍藻生物鐘是最有利的研究模型之一。

雖然藍藻生物鐘是目前已知的最簡單的生物鐘，但由KaiA、KaiB、KaiC蛋白組成的藍藻生物鐘核心振蕩器的動態機制十分復雜。目前對KaiA作用機制的研究揭示了其影響輸入、輸出信號，并調控核心振蕩器，維持生物振蕩的精確與穩定。對KaiA作用機制的研究仍存在一些需要解決的問題：例如KaiA的單體-二聚體轉變是否在振蕩系統中起重要作用；KaiA的N端結構域在動態周期中發揮怎樣的功能；外界信號是否通過調控KaiA的N端結構域達到對該振蕩體系進行調控；KaiA如何通過與細胞的代謝活動相關聯進而穩定核心振蕩器。對于這些問題的解決，可能需要通過生物學、物理學、數學分析等各種手段獲取Kai蛋白在動態作用過程中的相關信息。利用X射線晶體衍射和電鏡三維重構技術測定生物鐘蛋白的三維結構有助于我們了解生物鐘蛋白相互作用的分子細節。生物鐘蛋白的進化樹分析也能幫助我們理解不同物種間生物鐘的潛在聯系和機制。

這些問題的解決不僅對理解藍藻的生物鐘運行機制有重要意義，同時能以此為基礎去研究更為復雜的真核生物如哺乳動物的生物鐘，進而為生物鐘的應用提供科學的指導。比如，哺乳動物因生物鐘的紊亂造成肝臟代謝的異常，可以根據哺乳動物生物鐘所處的時相特點給與相應劑量的藥物治療。腸道細菌也有明顯的生物節律，腸道細菌的代謝紊亂將加重營養吸收方面的負擔，理解腸道細菌的生物節律將能為食物的攝取和營養的吸收提供科學的依據。穩定的生物節律能讓植物更好地進行光合作用，適應土壤環境，從而提高植物農作物的產量，對生物鐘系統與外界環境信號聯系機制的研究將為生物鐘系統的穩定提供清晰的見解。所以，生物鐘系統的研究在疾病預防、農牧業生產乃至進化層面具有重大意義。