基因敲除小鼠技術的研究進展

王超玄，孫航

重慶醫科大學附屬第二醫院病毒性肝炎研究所，重慶 400010

近年來人們的關注點逐漸轉向闡明基因功能并尋找可能具有治療價值的基因產物，實驗動物在人類疾病機制的研究中發揮了重要作用。在模型生物中，小鼠模型在人類生物學和疾病的研究中有著特別的優勢：1) 小鼠是哺乳動物，其發育、生理、行為和疾病與人類有很多共同之處；2) 幾乎所有 (99%) 小鼠基因在人類中都有同源物；3)小鼠基因組通過胚胎干細胞 (Embryonic stem cell，ESC) 中的同源重組支持特定基因的定向誘變，從而允許基因有效且精確地改變。

20世紀80年代后期開發的敲除ESC和小鼠中特定基因的能力使得人們對某些基因與疾病之間的關系有了更加全面的認識。目前的敲除技術還可以在時間和空間上對敲除的基因進行有效的控制，借助生物遺傳學的力量，為哺乳動物的生理和疾病研究提供支持。文中就目前已有的基因敲除小鼠的技術進行小結。

1 常規基因敲除小鼠技術

基因敲除小鼠技術是指通過基因工程的方法使小鼠體內某種基因功能缺失的生物技術。它以基因靶向技術、小鼠ESC的分離和培養技術為基礎。制作基因敲除小鼠主要有兩種方法：基因打靶和基因捕獲。基因打靶技術基于成功的ESC培養和體外同源重組，在研究基因敲除引起小鼠基因組中功能喪失及突變方面較為常用。第一次小鼠基因打靶實驗于1989年完成，30年來基因打靶加速了對于基因功能的研究，并為生物學研究提供了重要生物資源。2007年，三位科學家Mario R.Capecchi、Oliver Smithies和Martin J.Evens因對基因打靶技術的重要研究而獲得諾貝爾獎[1]。基因捕獲是作為基因靶向技術的替代方法而開發出來，它是一種高通量的和隨機突變的技術，盡管不像基因靶向技術那樣特異，但是通過誘捕可以在短時間內制作大量基因敲除小鼠[2]。

1.1 基因打靶技術

通過基因打靶進行遺傳修飾有助于推動生物醫學的研究，基因打靶的本質是通過同源重組(Homologous ecombination，HR) 替換內源基因。HR定義為在DNA上的兩個同源區域之間發生的基因組重排[3]。HR的生物學特征是修復雙鏈DNA斷裂 (DSZBs)，重新啟動停滯的DNA復制叉和減數分裂重組[4]，通過這種方式可以將基因定向破壞，稱為敲除 (Knockout，KO)；或用作轉運基因插入的停靠位點，稱為敲入 (Knockin，KI)。通過同源重組將位點特異性修飾引入ESC的基因組中稱為基因靶向的過程，這一過程由電穿孔法將靶向載體引入ESC中實現[5]。

標準基因打靶載體含有兩個與靶基因座位點同源的區域，稱為“靶向臂”，位于選擇性標記基因側翼[6]。靶向載體也稱之為DNA構建體，通常由3個基本單元組成：1) 5′端同源臂；2) 陽性可選擇基因標記，如新霉素抗性基因(Neo)或潮霉素抗性基因 (Hyg) 等；3) 3′端同源臂。轉染的靶向載體可以隨機插入基因組中，或通過5′端和3′端同源臂確定的同源重組整合。通過在含有新霉素或其他適當的抗生素的培養基中培養ESC，可以正確選擇成功轉染的細胞。如果陽性選擇標記基因側翼為LoxP或重組翻轉酶 (Lippase，FLP) 位點，則可以通過在重組ESC中表達Cre酶或FLP從ESC或轉基因小鼠中的靶向基因座中去除它，或通過嵌合體小鼠與表達Cre或FLP的轉基因小鼠雜交去除[7-8]。

影響HR效率的主要因素有兩個。第一，在培養皿中使用ESC代替整個生物進行基因靶向選擇。第二，基因靶向選擇包括兩個主要步驟：1) 鑒定基因組中包含有共定位靶向載體的ESC，這是通過設計新霉素抗性實現的，新霉素抗性基因包括靶向載體的同源區域；2) 鑒定通過同源重組發生靶向載體摻入的ESC，即通過替換內源基因，插入隨機基因座，這一步通過構建同源區域下游的胸苷激酶盒實現[9]。因此，這種雙重選擇方案有助于研究者快速有效地鑒定內源基因被靶向載體替換的ESC。因為靶向載體含有非陽性序列，例如新霉素盒，位于目的基因的重要外顯子中間，當靶向載體取代了內源基因，或者在編碼區上游或上下游都具有終止密碼子時，蛋白質不會發生表達，或由于蛋白質結構發生改變導致喪失其生物學功能。因此，用這種技術誘導的突變被稱為失效突變，并且由于轉基因小鼠攜帶這種突變，稱為敲除或失效突變小鼠[10]。

人們通常使用基因打靶技術將目的基因敲除，根據其作用方式不同可分為條件基因敲除法、誘導基因敲除法等，這些方法都是建立在DNA同源重組技術原理之上的，下文將對其進行闡述。

1.2 基因捕獲技術

1989年Gossler等發表了第一篇基因捕獲論文，目的是識別小鼠中控制胚胎發育的基因[11]。在這篇文章中他們構建了一個可以監測整合位點附近內源基因表達的載體，該載體被稱為“捕獲載體”。1991年，Friedrich和Soriano報道了一種改進的啟動子捕獲系統[12]，他們使用具有新型報告基因的質粒和逆轉錄病毒捕獲載體β-geo，β-geo的作用是編碼具有β-半乳糖苷酶和新霉素磷酸轉移酶活性的融合蛋白，來自β-geo基因的產物能夠在ESC培養物中進行藥物選擇并使被捕獲基因的組織定位可視化[13]。隨后Niwa和Wurst等使用多聚腺苷酸化 (polyA) 捕獲載體的方法制作了一種用于篩選小鼠發育調控基因的大規模基因捕獲技術[14]。此后大規模的基因捕獲技術迅速擴展到世界范圍。

誘捕基因的技術大致分為兩種：啟動子捕獲和polyA捕獲[14]。在啟動子捕獲中，捕獲載體使用具有連接到剪接受體下游啟動子的抗藥性基因，當捕獲載體插入ESC的表達基因中時抗性基因將隨著啟動子活性表達，抗藥性克隆通常反映基因捕獲，使得該方法對于篩選發生基因捕獲的ESC非常有效。有研究顯示可以將捕獲載體插入ESC的非表達基因中，然而這些ESC不會具有耐藥性，導致無法分離這些ESC。在polyA捕獲中抗藥性基因具有啟動子但不具有polyA序列，因此只有當捕獲載體可以表達小鼠內源基因的polyA添加序列時ESC才具有耐藥性。該方法的優點是可以捕獲ESC中的非表達基因，缺點是polyA捕獲載體的整合位點集中在捕獲基因的末端內含子中。Shigeoka等提出的研究證據表明，這種顯著的滯后效應是由于polyA捕獲過程中引起的mRNA降解，又被稱為無義介導的mRNA衰變 (Nonsense-mediated mRNA decay，NMD)[15]，為了克服這個缺點他們開發了一種新的polyA捕獲策略，即尿激酶型纖溶酶原激活物(Urokinase plasminogen activator，UPA) 捕獲，UPA捕獲可以抑制選擇標記mRNA的NMD并能夠捕獲轉錄沉默基因而沒有載體整合位點的偏移。由于產生了捕獲基因和藥物抗性基因之間的融合mRNA，因此在兩種方法中捕獲的基因均容易被鑒定。在啟動子捕獲中，位于載體插入位點上游的外顯子信息可以通過5′-RACE獲得。在polyA捕獲中，位于載體插入位點下游的外顯子信息可通過3′-RACE獲得[16]。

盡管質粒載體可以通過電穿孔等方法遞送到ESC中，但經常會出現基因捕獲載體的多拷貝插入、多聯體、缺失以及整合位點的重排。相反，逆轉錄病毒載體整合到小鼠基因組中不會引起宿主側翼序列的重排。逆轉錄病毒基因捕獲的另一個優點是逆轉錄病毒介導的整合多發生在基因5′末端的DNaseⅠ超敏性位點附近，這增加了產生無效等位基因的頻率。Friedrich和Soriano展示了用于基因捕獲的兩種載體，分別是質粒載體(SAβ-geo) 和逆轉錄病毒載體 (ROSAβ-geo)[17]。因為包含多腺苷酸化信號序列以終止基因轉錄，所以基因捕獲元件以反向病毒轉錄的方式插入長末端重復序列 (Long terminal repeat，LTR) 之間，以避免干擾病毒包裝。ROSAβgeo26 (RASA26)捕獲小鼠系在胚胎發育過程中顯示出報告基因的普遍表達，因此它可用作嵌合體實驗中的標記物[18]。

基因捕獲技術敲除基因的本質是以報告基因為誘餌來捕獲基因，其基本過程是在基因組中插入一段含有報告基因的DNA載體以產生內源基因的失活突變，通過觀察報告基因的表達提示已產生插入突變。通過篩選得到的插入突變的ESC克隆經囊胚注射轉化為基因突變動物模型，每一種ESC克隆中含有不同的突變基因，在短期內可建立大量含不同基因突變的ESC克隆庫。突變基因序列可通過基于PCR的一些方法鑒定，同時還可能發現一些在體內表達或不表達的新基因。

2 條件基因敲除小鼠技術

條件基因敲除技術是指在小鼠發育的特定階段或特定細胞組織類型中將目的基因進行敲除的技術。其本質是基于常規基因敲除技術，通過重組酶Cre對靶位點進行特異性重組，可以對小鼠的基因組修飾進行時間和空間上的調控[19]。自1994年GU等研制的第一例基于Cre/loxP系統的組織特異性基因敲除小鼠問世以來，條件基因敲除技術迅速取代傳統的完全基因敲除技術成為主流[20]。

2.1 Cre/loxP系統

Cre重組酶來自噬菌體P1，大小約為38 kDa。它可以作用于兩個LoxP位點之間使其發生特異性的同源重組。LoxP序列長約34 bp，由兩個13 bp的反向重復序列組成，中間被8 bp的非回文序列分隔開，這段序列決定了整個LoxP位點的方向[21]。Cre重組酶無法切除相反方向的LoxP位點之間的DNA序列，而位于同一方向的LoxP位點之間的DNA序列可以被切除。

Cre/loxP系統已成為生物遺傳操作的有力工具，幾乎所有感興趣的DNA序列都可以使用兩端插入LoxP位點的方式來刪除[22]。此外Cre重組酶的條件性 (時間或空間控制) 表達使得能夠保證在特定部位 (例如在特定細胞類型或組織中)以及特定時間 (在小鼠細胞及組織發育的特定階段) 刪除DNA序列。對于條件位點特異性的基因組修飾通常需要兩種小鼠：第一種是將具有目的DNA序列的小鼠側翼插入LoxP位點即Floxed小鼠。第二種是Cre重組酶轉基因小鼠，Cre重組酶在啟動子的控制下瞬時表達，這些啟動子僅在特定細胞類型或組織中表達活性，或在細胞及組織的特定發育階段具有活性。當使用Cre轉基因小鼠與Floxed小鼠交配時，插入floxed的DNA序列在表達Cre的特定細胞類型或組織中被刪除[23]。

Cre/loxP系統不僅可以刪除目的基因，還可以特異性地激活目的基因表達。例如通過在目的基因兩端插入介導轉錄停滯的多聚腺苷酸化信號序列即LoxP序列使目的基因呈現出靜止狀態[24]，再與Cre轉基因小鼠交配或將Cre遞送到floxed轉基因小鼠中，通過Cre介導的切除效應除去LoxP序列，激活特定細胞類型或組織中的基因表達。這種Cre/loxP介導的基因活化可以避免該基因在小鼠胚胎發生過程中的有害影響或誘導針對轉基因小鼠的免疫耐受性，例如通過靜脈內注射Cre腺病毒產生的條件性表達人丙型肝炎病毒(HCV) 的轉基因小鼠，用以研究HCV感染的免疫應答和發病機制[25]。

另一種重組系統是酵母FLP/FLP識別靶標(FLP recombination target，FRT)，其機制與Cre/loxP重組系統相同，可以作為Cre/loxP的替代工具[26]。此外，兩種重組系統的組合可以顯著增加小鼠條件基因敲除的操作潛力[27]。

2.2 CRISPR/Cas9系統

CRISPR/Cas9系統由CRISPR基因和Cas9核酸內切酶組成，CRISPR首次發現于1987年，是一種包含短重復序列 (20–50 bp) 的DNA片段[28]，CRISPR基因存在于超過40%的細菌和90%的古細菌的基因組中。最近發現一組名為Cas (或稱CRISPR相關基因) 的基因與CRISPR密切相關[29-30]。Cas基因編碼一種核酸酶及解旋酶蛋白，它可以解開和切割DNA序列。目前發現CRISPR/Cas有6種(Ⅰ–Ⅵ) 類型，其中Ⅱ型由3種成分組成：靶特異性CRISPR衍生RNA (crRNA)、靶獨立反式激活RNA (tracrRNA) 和Cas9核酸酶，它們廣泛地應用于基因工程中[31]。

CRISPR/Cas9系統的基本原理是：首先crRNA將Cas9復合物引導至靶序列，tracrRNA與crRNA結合并與Cas9核酸酶形成核糖核蛋白復合物，然后Cas9以靶向方式切割染色體DNA，產生位點特異性DNA雙鏈斷裂 (Double-strand breaks，DSB)。通過HR或非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ) 的內源性DNA修復系統可以在細胞中有效修復這些DSB[32]。crRNA和tracrRNA的基礎部分可以連接形成單鏈指導RNA (sgRNA)，sgRNA的堿基可以與靶標DNA配對編程靶向目的序列[33]，唯一的限制是sgRNA結合位點必須與短DNA基序相鄰，稱之為原型間隔相鄰基序 (Protospacer adjacent motif，PAM)[34]。在PAM處人工設計sgRNA，sgRNA可以與目的基因的靶序列特異性結合；Cas9核酸酶在sgRNA引導下對靶序列進行切割，導致DNA雙鏈斷裂。通過HR、NHEJ等機制對切斷的雙鏈進行修復，在斷裂處插入異常堿基或使堿基缺失，導致移碼突變，最終實現目的基因敲除 (圖1)[35-36]。

圖1 CRISPR/Cas9介導的基因修飾流程圖Fig.1 Genetic modification flow chart by CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9技術編輯胚胎基因組主要包括3個步驟：1) 從超排卵的雌性中分離受精卵；2)將sgRNA和Cas9 mRNA遞送到受精卵中；3) 隨后將胚胎轉移到假孕動物中以產生F0代 (圖2)[37]。2013年Jaenisch實驗室應用CRISPR/Cas9技術成功構建了第一個基因敲除小鼠，研究者將Tet1和Tet2 sgRNA與Cas9 mRNA一起注入受精卵，產生的基因敲除小鼠中這兩種基因的突變率達到80%[38]。此項研究表明CRISPR/Cas9系統是一種快速、便捷和有效的生產敲除小鼠的方法，為轉基因動物的產生提供了新的技術平臺[39]。迄今為止，該技術已成功應用于多種生物中，包括大鼠[40]、豬[41]、山羊[42]、兔子[43]、狗[44]、猴子[45]和人類胚胎[46]。Cas9/sgRNA指導的基因編輯通過在單鏈寡核苷酸模板的存在下將Cas9 mRNA和sgRNA共注射到受精卵中可以實現特異和精確的基因組編輯，包括敲除、敲入和基因修復。例如Yang等通過共注射Cas9、sgRNA和相應的基因DNA載體至受精卵中，在nanog、sox2和oct4基因中產生攜帶標簽或熒光報告構建體的小鼠[47]。通常情況下，基因組編輯中涉及大片段的DNA插入、缺失或倒位時都存在效率低下的問題，片段越大重組效率越低[48]，而Cas9系統由于具有同一染色體中兩個不同靶向基因座的sgRNA可以顯著提高重組效率，已被用于高效處理基因組中大片段的DNA。例如Fujii等通過將同一染色體中不同基因座的兩個sgRNA注射到受精卵中，產生大片段(約10 kb)基因組修飾的小鼠，達到了33%的敲除效率[49]。此外Zhang等的研究表明Cas9系統可以實現大片段的DNA缺失和插入，他們通過將兩個環狀質粒共注射到受精卵中實現了大小為65 kb的Dip2a基因缺失和大小為5 kb的lacZ報告基因插入[50]。因此，CRISPR/Cas9系統與兩種sgRNA一起使用，是用于大基因組DNA片段操作的簡單且有效的方法，可以加速動物模型的產生，便于研究疾病的機制和尋找治療靶點。

CRISPR介導的基因組編輯可以用于糾正與遺傳性疾病相關的基因突變。Wu等首次報道了使用CRISPR/Cas9系統進行基因修復[51]，他們選擇了一種由Crygc基因突變引起的顯性白內障疾病的小鼠模型，在3號外顯子中造成1 bp的缺失，引起第76位氨基酸的終止密碼子和截短的γC-晶狀體蛋白的產生，導致純合子和雜合子小鼠白內障。為了糾正Crygc基因的突變，研究者將突變等位基因的Cas9 mRNA和sgRNA共注射到受精卵中，內源等位基因或外源提供的模板通過HR進行校正以達到基因修復的目的[51]。杜氏肌營養不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種遺傳性疾病，其特征是進行性肌肉無力和壽命縮短，目前尚無有效的治療方法。DMD的分子基礎是肌營養不良蛋白基因的23號外顯子中的C至T點突變，其導致骨骼肌蛋白的完全缺失，而將Cas9 mRNA、sgRNA-DMD和外源單鏈寡核苷酸模板共注射到受精卵中，可以通過mdx小鼠種系中的HR修復來校正DMD的點突變[52]。這些進展表明我們距離CRISPR/Cas9最終應用于人類基因治療并不遙遠，然而Cas9/sgRNA是否可用于治療多基因疾病或染色體結構變異需要進一步研究。

圖2 CRISPR/Cas9技術構建基因敲除小鼠Fig.2 Gene knockout mice by CRISPR/Cas9 technology.

3 其他基因敲除方法

3.1 ZFN技術

鋅指核酸酶 (Zinc finger nucleases，ZFN) 是與DNA的多聚體鋅指蛋白結構域相結合的工程化蛋白質，其中能夠特異性結合三聯體DNA序列的單個鋅指基序連接在一起，形成具有核酸酶活性的限制性內切酶FokⅠ[53]。鋅指結構域的可塑性允許研究者對ZFN進行設計，特異性則可以與目的序列特異性結合[54-55]。核酸酶結構域也可以用于切割靶序列，但是核酸酶結構域必須形成二聚體才可以切割雙鏈DNA，所以需要兩個ZFN來定位特定序列。當引入細胞時，兩個ZFN與它們各自的結合位點結合，使它們的核酸酶結構域相互作用并在染色體中形成位點特異性雙鏈斷裂(Double-strand break，DSB)，隨后使用高度保守的同源依賴性修復 (Homology- dependent repair，HDR) 或非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ) DNA修復途徑修復該斷裂[53]。在HDR的情況下，序列可以被精確修復并且ZFN異二聚體可以在修復的靶序列上重新形成并重新切割。由于NHEJ介導的修復不如HDR準確，它偶爾會導致核苷酸的丟失或添加從而導致突變[56]，這種突變通常導致基因編碼序列中發生移碼現象從而形成截短的或無義的肽鏈。從果蠅的開拓性實驗開始[57]，工程化的ZFN已被用于在來自多個物種的多種細胞和胚胎中產生位點特異性突變[58-59]。將ZFN技術初步應用于大鼠實驗后研究者發現在基因中產生特異性突變位點時體現出驚人的高效率，通過將體外轉錄的ZFN編碼核酸與單細胞胚胎組合，ZFN可用于在大鼠中產生可遺傳的、位點特異性的靶向突變[60]。

ZFN基因敲除策略主要有3個優點。首先該技術非常迅速，整個過程僅需要幾個月。其次它在所有菌株中都有效果[61-62]。第三，它不會導致外源DNA的摻入。ZFN當前的一個主要限制是需要從現有文庫組裝ZFN的序列，這可能妨礙設計的選擇性。另一個限制是潛在的脫靶效應，其中ZFN在非靶向的基因座處引起DSB和突變。在ZFNs應用于斑馬魚中時出現了這種效應[63]，通過回交可以減輕罕見脫靶事件的潛在影響。

ZFN可以與目的基因位點進行特異性結合，在核酸酶的作用下切割靶位點形成DSB，隨后通過HDR或NHEJ進行自我修復來實現靶基因的刪除與插入。由于ZFN技術可以通過多種重組方法進行切除后的DNA修復，與傳統的基因敲除技術相比ZFN技術的敲除效率大大提升，但是由于ZFN技術存在脫靶這一亟待解決的問題，ZFN技術還不能完全取代傳統的基因敲除小鼠技術。

3.2 TALEN技術

與ZFN類似，另一種稱為轉錄激活因子樣效應核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALENs) 的嵌合核酸酶系統已成為基因工程的另一個優秀工具。TAL (Transcription activator-like，TAL) 的DNA結合域的結構特征非常典型，包括15.5–19.5個重復單元串聯排列，每個重復單元包含34個高度保守的氨基酸，最后一個單元通常僅有20個氨基酸被認為是半個復合單元[64]。與ZFN一樣，TAL存在與FokⅠ核酸內切酶結合的DNA結合基序[65-66]，由特定的TAL(Transcription activator-like，TAL) 與FokⅠ內切酶結合形成TALENs，Fok Ⅰ必須以二聚體的形式存在才具有活性[67]，所以TALENs由兩個活躍的單體組成，分別結合在兩個靶位點，形成二聚體進行位點特異性切割。被TALENs切割產生的DSB可以通過NHEJ和HD兩種方式修復。但是，TALENs與ZFN的不同之處在于如何組裝DNA結合域 (DNA-binding domain，DBD)，與識別3個堿基對的ZFN不同，每個TAL的效應子模塊與單個堿基對結合[65-66]，TAL效應子DNA結合基序天然存在于植物病原細菌分泌的蛋白質中，每個效應子模塊由34個氨基酸組成，殘基12和13可以被DNA識別，也稱為重復序列可變的雙氨基酸殘基 (Repeat-variable di-residues，RVDs)，它決定相應重復單元識別單個核苷酸的特異性。通過基于目標序列選擇RVD，可以更容易地組裝TALENs集合[68-69]。研究者可以很容易地從TALENs組文庫收集TAL組合，這個文庫目前已組裝了18 700個人蛋白質編碼基因[70]。易于組裝、易于基因打靶的特點使TALENs技術成為基因工程應用的有力選擇[68,71]。到目前為止，已有研究者成功地將mRNA直接注射到豬和牛的一個細胞胚胎的細胞質中，證明了基因的靶向性。將TALENs遞送到成纖維細胞中，在將近10%的細胞中產生雙等位修飾并且靶向定位于同一染色體的兩對TALENs的共轉染能夠產生大量的染色體缺失或倒位[72]。TALENs的一個主要問題是在脫靶位點的潛在分裂，使用特異性異二聚體FokⅠ核酸酶與TALENs的合理設計相結合可以緩解這些問題[73]。

TALENs技術由于操作的便捷性及較高的基因靶向特異性使得它成為基因工程的有力選擇，迄今為止TALENs技術已被應用于不同物種的基因組編輯中，例如小鼠、酵母、水稻和玉米等[74]。與ZFN技術相比，TALENs技術可以更加特異的識別目的基因并且不受其上下游序列的影響，但是與ZFN技術一樣由于存在脫靶效應使得TALENs技術還不能完全取代傳統的基因敲除技術。

4 結語

小鼠基因敲除技術提供了一種闡明生物體內基因功能的有力手段。目前為止，由基因敲除小鼠構建的疾病模型已有接近100種，通過對模型的建立和分析研究使得人們對部分疾病有了更加系統的認識并由此尋找新的治療靶點。基因敲除小鼠技術的建立是生命科學領域內一項偉大的發明。