苗期耐低磷煙草基因型篩選及其磷效率

龔絲雨，梁喜歡，鐘思榮，楊帥強，張世川，朱肖文，王 朝，劉齊元

（江西農業大學農學院/作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室，江西南昌 330045）

磷是植物生長發育過程中的必需營養元素之一，它不僅是植物的構成成分，還參與植物能量轉化與物質代謝[1-2]。在農業生產中，土壤缺磷已成為限制作物高產優質的主要因子之一[3]。據統計，我國有60%以上的土壤嚴重缺磷[4]，盡管土壤總磷含量很充足，但能被植物吸收利用的有效磷卻很低[5]。在實際生產中，人們為了追求作物高產而大幅度增施磷肥，磷肥不僅當季利用率低[6]，還極易被土壤固定或被微生物轉化為無效態磷[7]。此外，增施磷肥還會引起磷資源浪費、施肥成本增加、環境污染[8]等一系列問題。有研究表明，同一作物不同品種間對磷素的利用效率存在顯著差異[9]。因此，充分利用不同基因型作物的固有生物學特性，篩選耐低磷及磷高效品種對解決土壤磷資源危機和提高磷素利用率具有重要意義。迄今大豆[10]、玉米[11]、水稻[12]、小麥[13]、高粱[14]、油菜[15]等作物不同品種磷高效利用的研究工作已相繼開展，而煙草作為我國重要的經濟作物之一，在磷效率基因型差異及機理研究方面報道較少。高家合等[16]通過盆栽和培養基試驗，研究了17個煙草品種的磷效率差異并進行分類。徐敏等[7]采用漂浮育苗試驗，比較了5個不同基因型烤煙在缺磷和正常磷條件下的苗期生物學性狀和生理特性。李華麗[17]研究了不同磷素水平對翠碧一號烤煙的影響。以上研究主要針對少數品種的耐低磷能力展開，且有的是采用土培試驗，肥力和水分難以控制到均勻一致，結果可能具有不確定性。煙草苗期磷素營養狀況直接影響煙苗的生長發育及最終產量和質量，且苗期篩選能增加供試品種的數目與種類，使試驗費用減小。本試驗采用營養液水培法，研究了71個煙草基因型苗期磷素響應狀況的差異性，觀測在低磷與正常磷供應水平下不同煙草品種株高、莖粗、總根長、干重等指標變化，通過指標統計、因子分析和聚類分析等方法篩選出耐低磷煙草基因型并劃分不同磷效率類型，旨在為進一步研究煙草耐低磷特性遺傳規律、保存耐低磷品種及提高磷肥利用率提供種質資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為國家煙草種質資源子平臺和江西省煙葉科學研究所提供的71個煙草品種。

1.2 試驗方法

試驗于2017年在江西農業大學實驗基地內進行。采用漂浮育苗，在Hoagland完全營養液中培育煙草，在四葉一心期挑選長勢一致的煙苗分別在正常磷(1.0 mmol/L KH2PO4)和低磷(0.01 mmol/L KH2PO4)營養液處理，每個處理6 株苗，重復3次。正常磷處理營養液[18]組分為2.5 mmol/L NH4NO3、1.0 mmol/L KH2PO4、2.4 mmol/L K2SO4、4.6 × 10-2mmol/L H3BO3、5.0 mmol/L CaCl2、2.0 mmol/L MgSO4、9.0 × 10-3mmol/L MnCl2·4H2O、7.65 × 10-4mmol/L ZnSO4·7H2O、3.7 × 10-2mmol/L Fe-EDTA、3.2 × 10-4mmol/L CuSO4、1.6 × 10-5mmol/L (NH4)6MO7O24。低磷處理營養液中KH2PO4濃度為0.01 mmol/L，其余與正常磷處理相同，用KCl補充鉀。營養液pH統一調為6.0。試驗每隔3天更換一次營養液，以氧氣泵連續通氣，培育期間注意防蟲防病，處理21 d后測定各項指標。

1.3 測定指標及方法

按照文獻[19]調查株高和莖粗等煙草農藝性狀，利用葉綠素儀(SPAD-502)測定煙葉SPAD值(葉綠素相對值)。將煙草根系沖洗干凈后，放入盛有少量水的淺皿中，使根系均勻展開，利用臺式掃描儀對樣根進行二維掃描以獲取根系圖像，再利用Win RHIZO根系分析軟件得出總根長、根表面積、根直徑等根系指標數據。將材料在105℃下殺青30 min，75℃烘至恒重后稱重獲得干重。采用H2SO4-H2O2消煮—鉬銻抗比色法[20]測定煙草全磷含量。為消除不同種質個體間差異，參照曹敏建等的方法[21]，以指標相對值來表示煙草不同基因型的耐低磷能力。

耐低磷指標相對值 = 低磷下某性狀測定值/正常磷下某性狀測定值

根冠比 = 根干重/地上部干重

磷累積量 = 干重 × 含磷量

1.4 磷效率綜合值計算及分類方法

利用模糊隸屬函數法[18,22]，以磷效率綜合值[23]來表示不同供磷條件下不同煙草品種的磷素營養狀況。

式中，Yij表示i品種j評價指標的磷效率隸屬函數；Xij表示i品種j評價指標的測定值；Xjmin、Xjmax分別表示j評價指標的最小、最大測定值。

1.5 數據分析

利用Microsoft Excel 2007和SPSS 22.0分析軟件進行數據統計，采用獨立樣本t檢驗各指標均值，利用最大方差法正交旋轉進行因子提取，運用Heml 1.0 Heatmap Illustrator軟件進行聚類熱圖分析，利用SPSS 22.0繪制散點圖。

2 結果與分析

2.1 低磷脅迫對煙草苗期農藝性狀的影響

表1表明，在低磷脅迫下煙草苗期各性狀都受到不同程度的影響，從變幅與均值來看，煙草株高、莖粗、SPAD值、全株磷累積量、根干重、地上部干重、根直徑均顯著減小，總根長顯著增大，根表面積和根冠比略有提高，但未達到顯著水平。在低磷條件下，變異系數呈全株磷累積量 ＞ 地上部干重 ＞ 株高 ＞ 根干重 ＞ 根直徑 ＞ 總根長 ＞ 根冠比 ＞ 莖粗 ＞ SPAD值 ＞ 根表面積的趨勢，其中以全株磷累積量變異系數最大，根表面積最小。正常供磷時，變異系數呈地上部干重 ＞ 根干重 ＞ 總根長 ＞ 全株磷累積量 = 株高 ＞ 根直徑 ＞ 根冠比 ＞ 莖粗 ＞ SPAD 值 ＞根表面積的趨勢，其中變異系數最大與最小分別為地上部干重和根表面積。綜合分析，不管在低磷還是在正常供磷條件下，苗期全株磷累積量、地上部干重、根干重、株高、總根長、根直徑的變異系數均較大，在耐低磷特性上品種間存在較大差異，有利于篩選耐低磷基因型，故可初步將這些性狀作為鑒定煙草耐低磷基因型較好的苗期篩選指標。

2.2 因子分析

將耐低磷指標相對值進行因子分析并進行正交旋轉，提取的3個主因子信息見表2。3個主因子特征值的累積貢獻率達80.671%，則說明主成分能夠較好地代表原始數據的大部分信息。第1、2、3主因子的特征值分別為4.395、2.542、1.130。全株磷累積量、地上部干重、根干重、莖粗及SPAD值在第1主因子上有較高荷載量；第2主因子在總根長、根直徑上載荷較大；第3主因子在根表面積和株高上具有較高載荷量。

表 1 不同供磷條件下煙草苗期主要性狀特征Table 1 Characteristics of the main trains in tobacco seedlings under low and normal phosphorus supply

表 2 方差極大正交旋轉因子載荷矩陣方差Table 2 Loading matrix of varimax rotation factors

各指標權重依照以下公式計算：

式中：Wj為指標權重；Wj*為權重分配系數；Fp為主成分p的方差貢獻率。

分析各指標權重發現，地上部干重和全株磷累積量的權重較大，前人研究[16,24-25]也多以低磷脅迫時的生物量或磷累積量作為植物磷效率的指標，故本試驗確定以全株磷累積量和地上部干重作為不同品種煙草耐低磷能力評價指標。

2.3 耐低磷煙草基因型篩選

分析表3可知，地上部干重和全株磷累積量相對值均值分別為0.51和0.40，其中以G28的地上部干重和全株磷累積量相對值最小，云煙87的地上干重相對值最高，NordelB的全株磷累積量相對值最高。

將地上部干重和全株磷累積量的耐低磷相對值進行熱圖分析，以顏色變化將數據大小直觀表達，通過顏色相似程度及深淺梯度反映數據相似性與差異性。采用平方歐式距離法擬合聚類分析，將71個煙草基因型分為4個類群(圖1)：第Ⅰ類群屬于低磷敏感基因型，地上部干重和全株磷累積量相對值均小，范圍分別為0.08～0.32和0.04～0.23，這類材料在低磷條件下不能正常生長，品種有21個，占29.58%，其中第Ⅰ類群中的G28和閔煙3號對低磷脅迫忍耐力最差，對低磷高度敏感；第Ⅱ類群地上部干重相對值中等，全株磷累積量相對值較小，范圍分別為0.35～0.48和0.22～0.37，有13個品種，占比18.31%；第Ⅲ類群地上部干重相對值較大，全株磷累積量相對值中等，范圍分別為0.54～0.79和0.40～0.69，品種有29個，占40.84%；第Ⅳ類群屬于耐低磷基因型，品種有8個，占比11.27%，地上部干重和全株磷累積量相對值均大，范圍分別為0.84～0.98和0.77～0.91，這類品種不僅能維持正常生長發育，還能較好地利用磷素，其中NordelB和云煙87對低磷脅迫具有高度忍耐力。第Ⅱ、Ⅲ類群屬于中間基因型，在磷脅迫中僅僅能維持生長。

2.4 磷效率綜合值分析

以全株磷累積量和地上部干重作為磷效率評價指標，通過磷效率綜合值來評價不同煙草基因型磷效率的優劣。表4表明，在低磷與正常磷條件下，磷效率綜合值的變幅分別為0.01～0.49和0.01～0.50，平均值分別為0.16和0.18。低磷時綜合值最大為K326，最小為G28，而正常磷時綜合值最大為MSKCH1，最小為Ti245、NC82和NX326。

基于磷效率綜合值，對不同基因型煙草作散點圖進行分類，依圖2可歸為四類：第Ⅰ類低磷高效正常磷低效型4個，占比5.63%；第Ⅱ類低磷高效正常磷高效型9個，占比12.68%；第Ⅲ類低磷低效正常磷低效型49個，占比69.01%；第Ⅳ類低磷低效正常磷高效型9個，占比12.68%。耐低磷品種中，有4個低磷低效正常磷低效型，2個低磷高效正常磷高效型(K326、云煙105)，2個低磷高效正常磷低效型。不耐低磷品種中有14個低磷低效正常磷低效型(G28、閔煙3號、DB101、Oxford 2028、14P10、CV70、云煙98、MSB44、單育2號、凈葉黃、CB1、中煙101、RG11、MSB31)，1個低磷高效正常磷高效型，6個低磷低效正常磷高效型。初步得出K326、云煙105屬于耐低磷且磷高效品種，G28、閔煙3 號、DB101、Oxford 2028、14P10、CV70、云煙98、MSB44、單育2號、凈葉黃、CB1、中煙101、RG11、MSB31屬于不耐低磷且磷低效品種。

表 3 不同供磷水平下煙草苗期地上部干重和全株磷累積量耐低磷相對值Table 3 Relative values of aboveground dry biomass and whole plant phosphorus accumulation at seedling stage under different phosphorus levels

圖 1 不同基因型煙草指標相對值聚類熱圖Fig. 1 Heatmap clustering for relative indicators in different tobacco genotypes

3 討論與結論

選育耐低磷、磷高效品種是解決作物磷素利用率低的有效途徑之一[26]。本試驗對71個煙草品種在兩個供磷水平下對磷素響應情況進行研究發現，低磷逆境致使煙株全株磷累積量、地上部干重和根干重顯著減小，說明低磷會抑制植株生長[16]。根冠比在低磷逆境中略有增大但未達到顯著水平，這是因為植物處于缺磷逆境時，地上部同化物向根系的運輸量會增多，地上部抑制比根系大得多[27]，此外，根冠比的增大程度與磷脅迫時間長短有關[28]。低磷水平下的SPAD值顯著低于正常磷水平，這與周建朝等[29]人的研究結果相一致，植物缺磷會使得光合磷酸化過程受阻，葉片光合作用受到抑制[30]。

表 4 不同供磷水平下煙草苗期磷效率綜合值Table 4 Comprehensive value of P efficiency of tobacco at seedling stage under low and high P levels

圖 2 不同供磷條件下不同基因型煙草磷效率綜合值散點圖Fig. 2 Scatter map of phosphorus efficiency comprehensive value in tobacco genotypes under different phosphorus levels

在低磷逆境中，植物根系是最先感受到養分脅迫的器官[31]。許多研究發現，植物會通過改變根系形態構型來適應低磷逆境，如根系變長變細[32-33]、根表面積擴大[34]等。本試驗表明，煙草在低磷條件下總根長顯著增大，根直徑顯著減小，根表面積略有提高但效果不顯著，根變細長得以增大與磷的接觸面積，從而提高磷吸收效率[35]。

進行煙草耐低磷基因型篩選的關鍵是確定簡單有效的評價指標。作物耐低磷基因型篩選及評價指標有很多，如酸性磷酸酶活性[11]、生物量[36]、磷累積量[25]、根長[37]等。通過分析各指標的描述統計結果發現，全株磷累積量、地上部干重、根干重、株高、總根長和根直徑可以初步作為煙草苗期耐低磷基因型的篩選指標，通過因子分析確定全株磷累積量和地上部干重作為煙草耐低磷和磷效率評價指標。

指標相對值作為重要的耐低磷指數已廣泛應用于很多作物耐低磷品種篩選及磷效率影響等研究領域[38-39]。為了確保篩選結果準確及防止單一指標造成的偏差，本文通過對全株磷累積量和地上部干重的相對值進行聚類分析，篩選出8個耐低磷品種和21個不耐低磷品種。對磷效率綜合值散點作圖發現，耐低磷品種中K326和云煙105屬于磷高效型，不耐低磷且磷低效型的品種有G28、閔煙3號、DB101、Oxford 2028、14P10、CV70、云煙 98、MSB44、單育2號、凈葉黃、CB1、中煙101、RG11和MSB31等14個。研究發現，K326比中煙100、中煙101更耐低磷脅迫，G28屬于磷低效低產型且對磷敏感，云煙105抗病性、外觀品質等特性與K326相當[16-17,40]，這在本試驗中皆得到驗證。還有學者[16]認為K326屬于磷敏感品種，RG11屬于磷高效高產型，而本試驗顯示K326對磷不敏感，RG11為磷低效型品種，推測結果不一致的原因是兩個研究采用的試驗方法、篩選方法和磷效率分類方式不同。值得注意的是，NordelB和云煙87的耐低磷能力為最強，但磷效率類型都屬于低磷低效正常磷低效型，這是因為低磷耐性是以指標相對值來表示，相對值僅能代表耐低磷能力而無法反映該品種在低磷和正常磷條件下磷效率的高低。而K326和云煙105不但對低磷脅迫具有較強的忍耐力，而且在兩種供磷水平下都能對磷素進行高效利用，是值得推廣的煙草品種。

本文初篩的是煙草苗期耐低磷和磷高效品種，為提高結果的準確性，尚需田間試驗作進一步驗證。