高產L-精氨酸谷氨酸棒狀桿菌的構建

王 婷，蔡檸勻，張德志，趙桂紅，徐慶陽，2，3，陳 寧，2，3*

（1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.天津科技大學 代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300457；3.天津科技大學 教育部工業發酵微生物重點實驗室，天津 300457）

L-精氨酸（L-arginine）屬于堿性氨基酸，是人體半必需氨基酸，其在生物體內具有重要的生理功能[1-5]，如治療心血管疾病、調節激素分泌、促進生殖系統發育、提高免疫力等，在食品、藥品、化妝品行業廣泛應用，市場需求量大。

L-精氨酸的生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法[6]。化學法合成精氨酸過程復雜，會產生有毒物質污染環境，而微生物發酵法具有環保、反應條件溫和和生產過程穩定的優點。隨著谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）全基因組測序及基因功能注釋的完善，通過基因工程手段定向改造C.glutamicum生產氨基酸越來越受重視。目前，已有許多菌株重構、改良菌株生產特性、提高L-精氨酸產量的相關報道。占米林[7]通過串聯表達pntAB和ppnK基因對C.glutamicum SNK118關鍵輔酶進行調節，解除argR和farR反饋阻遏，L-精氨酸的積累量為67.01 g/L，糖酸轉化率為0.35 g/g；PARK S H等[8]將C.glutamicum AR1中的阻遏蛋白基因argR和farR敲除后，L-精氨酸的積累量提高到61.9g/L；DOUW等[9]采用質粒過表達的方式在C.crenatum SYPA5-5中過表達關鍵基因argJ，使L-精氨酸的產量提高16.8%；IKEDA M等[10]敲除C.glutamicum ATCC 13032中的argR基因，過表達定點突變的argB基因，L-精氨酸產量增加到52.0 g/L。

本研究以一株高產L-精氨酸的誘變谷氨酸棒狀桿菌AJC為出發菌株，采用基因組編輯技術[11]，首先敲除阻遏蛋白ArgR和FarR，解除反饋阻遏；然后敲除乳酸脫氫酶編碼基因ldh和整合鳥氨酸乙酰轉移酶編碼基因argJ，阻斷乳酸合成途徑和增加前體物的生成；最后敲除谷氨酸分泌蛋白編碼基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶編碼基因argB，獲得高產L-精氨酸C.glutamicum重組菌株。目前已報道的L-精氨酸生產菌株多是用質粒過表達關鍵基因的方式，但質粒的存在會造成菌株產酸穩定性差、抗生素殘留及操作復雜的問題。因此本研究開發的無質粒高產氨基酸生產菌株將具有良好的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本研究所用菌株見表1。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in the study

1.1.2 引物

本研究所用引物序列見表2。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in the study

續表

1.1.3 培養基

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，121℃滅菌20 min。

腦心浸液培養基（brian heart infusion，BHI）：腦心浸液37.5 g/L，121℃滅菌20 min。

活化斜面培養基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 2.5 g/L，瓊脂20.0 g/L，玉米漿15.0 mL/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

種子培養基：葡萄糖35.0g/L，玉米漿30.0mL/L，酵母粉5.0g/L，豆粕水解液20.0mL/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB11.0 mg/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH 0.2 mg/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖100.0 g/L，玉米漿35.0 mL/L，（NH4）2SO410.0 g/L，豆粕水解液25.0 mL/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，VB11.0 mg/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH 0.1 mg/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

BHIS復蘇液：腦心浸液37.5 g/L，葡萄糖 5 g/L，115 ℃滅菌15 min。

1.1.4 試劑

Primer STARHS脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）polymerase（2.5 U/μL）、QuickCut限制性內切酶（120 U/μL）：大連寶生物工程有限公司；Taq聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）MasterMix、Clone ExpressRⅡOne Step Cloning Kit：南京諾維贊生物工程有限公司；質粒提取及DNA回收試劑盒：上海Omega Bio-tek公司；質粒pK18mobrpsl：本實驗室保藏。

1.2 儀器與設備

Mastercycler nexus PCR儀、Eppendorf Eporator電擊轉化儀：德國Eppendorf公司；GL20A高速冷凍離心機：日本日立有限公司；UV200紫外可見波長檢測器：美國Laballiance公司；Agilent 1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：安捷倫科技（中國）有限公司；SCD-II高純水裝置：美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 質粒構建與轉化

以谷氨酸棒狀桿菌基因組為模板，分別采用引物對ArgR-1和ArgR-2、ArgR-3和ArgR-4進行PCR擴增，再經重疊延伸PCR得到重疊DNA片段。使用限制性核酸內切酶Kpn I和Xba I對質粒pk18mobrpsl、重疊DNA片段進行酶切后，使用Clone ExpressRⅡOne Step Cloning Kit同源重組酶連接，獲得重組質粒pk18mobrpsl-ΔargR。PCR擴增體系：5×PS Buffer 10 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）mixture（10 mmol/L）4 μL、上下游引物各2μL、DNA模板約200 ng、HS酶（5 U/μL）0.5 μL、雙蒸水（ddH2O）補充至50 μL。PCR擴增條件：95℃預變性5 min；98℃變性10 s，適當退火溫度下退火15 s，72℃延伸適當時間（1min延伸約1kbp），30個循環；72℃再延伸10 min。

采用同樣的方法和模板，構建重組質粒pk18mobrpsl-ΔfarR（farR的上下游同源臂引物為FarR-1和FarR-2、FarR-3和FarR-4）、pK18mobrpsl-Δldh：：P tufargJ（ldh的上下游同源臂引物為LDH-1和LDH-2、LDH-7和LDH-8；P tuf和argJ的上下游引物分別為LDH-3和LDH-4、LDH-5和LDH-6）、pK18mobrpsl-ΔNCgl1221：：P sodargB（NCgl1221的上下游同源臂引物為B-1和B-2、B-7和B-8；P sod和argB的上下游引物為B-3和B-4、B-5和B-6）。

采用CaCl2介導的化學轉化法[12]將體外重組體系加至E.coli DH5α感受態細胞中，冰浴20 min，42℃熱激1 min，加入900 μL的LB液體培養基，在37℃、220 r/min條件下復蘇1 h，涂布于添加相應抗性的LB培養基平板中，37℃培養12 h，PCR鑒定后篩選正確轉化子，將其轉接至LB液體培養基（添加相應抗性），37℃過夜培養，收集菌體，按照質粒提取試劑盒說明書提取重組質粒。

1.3.2 重組菌株的構建

菌株基因組的編輯采用pK18mobrpsl無痕編輯系統[11]。采用電轉化法將上述構建的重組質粒與谷氨酸棒狀桿菌AJC感受態細胞混合后加入電轉杯，冰浴20 min，電擊，加BHIS復蘇液，46℃水浴熱激6 min，32℃、220 r/min條件下復蘇2 h，涂布于添加相應抗生素的BHI培養基的平板，32℃過夜培養，通過菌株兩輪單雙交換，PCR鑒定后篩選獲得重組菌株。

1.3.3 搖瓶發酵培養

使用斜面活化培養基，將菌體傳代兩次。取兩環活化的菌體接種于種子培養基，裝液量為30 mL/500 mL，32℃、220r/min條件下培養12h，OD600nm值約為15。再按10%（V/V）的接種量將種子液接種于發酵培養基，裝液量為30mL/500mL，32℃、220 r/min條件下培養64 h，定時取樣檢測發酵液中L-精氨酸的含量。

1.3.4 發酵罐培養

將斜面活化的菌體接于裝有60 mL種子培養基的1 L三角瓶中，32℃、220 r/min條件下培養16 h作為一級種子液。再將一級種子按10%的接種量接于裝有種子培養基的二級種子罐（2 L）中，裝液量為1.2 L/2 L，32℃、溶氧量20%～30%條件下培養至OD600nm值=14，作為二級種子液。按15%的接種量將二級種子接種于裝有發酵培養基的5 L發酵罐中，裝液量為3 L/5 L，發酵條件同二級種子罐；連續流加25%氨水，pH約7.0；按照一定的流加速率，補加80%的葡萄糖溶液，殘糖量維持在1%～1.5%。

1.3.5 測定方法

菌體濃度的測定：在發酵過程中，定時取樣、稀釋后，使用紫外分光光度計測定其在波長600 nm處的吸光度值。

葡萄糖含量的測定[13]：使用生物傳感儀測定葡萄糖含量。L-精氨酸[14]、L-谷氨酸[15]和乳酸[16]含量的測定：采用高效液相色譜法。

2 結果與分析

2.1 連續敲除基因argR和farR對L-精氨酸產量的影響

L-精氨酸的操縱子包含argCJBDFR和argGH兩部分，阻遏蛋白ArgR[17]會結合到這兩個操縱子上，降低這些基因的轉錄水平。此外，阻遏蛋白FarR[18]也會結合到arg的操縱子以及gdh基因的上游區域，導致基因表達量下降。為解除阻遏作用，增加L-精氨酸合成途徑的通量，將基因argR和farR連續敲除，構建解除反饋阻遏的敲除菌株AJC-1和AJC-2，并以出發菌株AJC作為對照組，經搖瓶發酵64 h后，測定發酵液中L-精氨酸的含量和菌體的OD600nm值，結果見圖1。

圖1 菌株AJC、AJC-1和AJC-2的OD600 nm值及L-精氨酸產量Fig.1 OD600 nm value and L-arginine production of strain AJC,AJC-1 and AJC-2

由圖1可見，與出發菌株AJC相比，菌株AJC-1和AJC-2的OD600nm值（38.5、37.0）分別降低3.8%、7.5%；L-精氨酸產量（28.1 g/L、30.3 g/L）分別提高6.4%和14.8%。結果表明，連續敲除基因argR和farR，重組菌株比出發菌株的生長略微變慢，但L-精氨酸的產量有了逐步提高。由此可見，解除出發菌株AJC的反饋阻遏作用后，促進了L-精氨酸的合成。

2.2 敲除基因ldh及強化關鍵基因argJ對L-精氨酸產量的影響

乳酸是L-精氨酸合成途徑中的代謝副產物，乳酸的合成會消耗大量能量和前體物丙酮酸，降低L-精氨酸的產量。為了減少副產物的積累、加強主要代謝通路碳代謝流[19]，削弱乳酸途徑對L-精氨酸合成的關鍵前體丙酮酸的競爭，可通過敲除基因ldh[20]的方式解決。此外，亦可強化關鍵基因argJ的表達，提高L-谷氨酸到L-精氨酸的轉化能力[21]。因此，在菌株ARG-2的基礎上敲除ldh，同時在該位點整合L-精氨酸合成的關鍵基因argJ，獲得的重組菌株ARG-3。以出發菌株AJC作為對照組，經搖瓶發酵64 h后，測定發酵液中的L-精氨酸含量、乳酸含量和菌體的OD600nm值，結果見圖2。

圖2 菌株AJC和AJC-3的OD600 nm值、L-精氨酸產量和乳酸含量Fig.2 OD600 nm value,L-arginine production and lactic acid content of strain AJC and AJC-3

由圖2可見，與出發菌株AJC相比，菌株AJC-3的OD600nm值（37.0）、乳酸積累量（0.1 g/L）分別下降7.5%、97.7%，L-精氨酸產量（32.1 g/L）提高21.6%。說明敲除基因ldh阻斷了乳酸途徑，進而阻止了該副產物的合成。由此可見，強化關鍵酶的表達，減少副產物途徑對碳源和前體物的消耗，對L-精氨酸的積累起到積極作用。

2.3 敲除基因NCgl1221及強化關鍵基因argB對L-精氨酸產量的影響

谷氨酸棒狀桿菌中基因NCgl1221編碼谷氨酸分泌蛋白[8]。為了減弱L-谷氨酸的胞外分泌，增加L-精氨酸發酵前體物的積累量，在菌株ARG-3的基礎上敲除基因NCgl1221，同時在該位點整合L-精氨酸的關鍵基因argB，最終達到增加L-精氨酸產量的目的。因此，構建重組菌株ARG-4并進行搖瓶發酵，以出發菌株AJC作為對照組，經搖瓶發酵64 h后，測定發酵液中的L-精氨酸含量、L-谷氨酸含量和菌體的OD600nm值，結果見圖3。

圖3 菌株AJC和AJC-4的OD600 nm值、L-精氨酸產量和L-谷氨酸含量Fig.3 OD600 nm value,L-arginine production and L-glutamic content of strain AJC and AJC-4

由圖3可見，與出發菌株AJC相比，菌株AJC-4的OD600nm值（30.2）和L-谷氨酸的積累量（0.2 g/L）分別下降24.5%、95.2%，L-精氨酸產量（34.3 g/L）提高29.9%。結果表明，敲除NCgl1221基因和過表達關鍵基因argB后，有效地減少了副產物積累和提高了關鍵基因的表達水平，進而提高了菌株的L-精氨酸產量。

2.4 谷氨酸棒狀桿菌AJC和AJC-4的分批補料發酵

2.4.1 菌體的OD600nm值、殘糖量和L-精氨酸產量的測定結果

為了進一步驗證重組菌株AJC-4生產L-精氨酸的能力，以出發菌株AJC為對照，對兩株菌進行分批補料發酵，菌體的OD600nm值、殘糖量和L-精氨酸產量測定結果如圖4所示。

圖4 分批補料發酵過程中菌株AJC和AJC-4的OD600 nm值、殘糖量和L-精氨酸產量的測定結果Fig.4 Determination results of OD 600 nm value,residual sugar content and L-arginine production of strain AJC and AJC-4 during fed-batch fermentation processes

由圖4可知，分批補料發酵過程中，對照菌株AJC和重組菌株AJC-4的OD600nm值、殘糖量和L-精氨酸產量的變化趨勢基本相同。菌體的對數生長期為0～24 h，之后菌體的生長趨于穩定；發酵0～24 h，葡萄糖含量快速下降，說明處于對數生長期的菌體需要獲取大量的碳源，消耗大量的葡萄糖，滿足自身快速生長的需要；發酵24 h后，殘糖量＜2.0%，然后通過流加80%的葡萄糖溶液，始終控制殘糖量在1.0%～1.5%。在發酵前期（0～20 h），菌體處于生長階段，L-精氨酸產量非常少，當菌體生長接近穩定期后，L-精氨酸的產量開始快速積累，在發酵64 h時，菌株AJC和AJC-4的L-精氨酸的產量均達到最大值，分別為64 g/L、78 g/L。然而，菌株AJC-4的OD600nm值始終低于出發菌株AJC，說明菌株在進行基因組編輯后，一定程度上影響了菌株的生長；重組菌株AJC-4消耗葡萄糖的速度明顯慢于出發菌株AJC，說明改造后菌株可減少碳源的消耗；重組菌株AJC-4的L-精氨酸產量（78.0g/L）較出發菌株AJC（64.0g/L）提高了21.9%。此外，在菌株正常生長的情況下，重組菌株AJC-4的糖酸轉化率為0.38 g/g，高于出發菌株AJC（0.32 g/g），提高了18.8%。

2.4.2 乳酸和L-谷氨酸含量的測定結果

菌株AJC、AJC-4在5 L發酵罐中分批補料發酵64 h后，測定發酵液中的乳酸和L-谷氨酸的積累量，結果如圖5所示。

圖5 分批補料發酵過程中菌株AJC和AJC-4的副產物積累量Fig.5 By-product accumulation of strain AJC and AJC-4 during fed-batch fermentation processes

由圖5可知，在敲除ldh和NCgl1221基因后，乳酸和谷氨酸的分泌幾乎降為零。說明成功阻斷乳酸合成途徑和谷氨酸分泌蛋白的合成，有效地消除了副產物的積累和分泌。

3 結論

本研究以產L-精氨酸的誘變菌株谷氨酸棒狀桿菌AJC為出發菌株，通過基因敲除和基因整合，阻斷副產物乳酸和L-谷氨酸的積累，構建了一株L-精氨酸高產菌株AJC-4。菌株AJC-4經分批補料發酵64 h后，L-精氨酸產量和糖酸轉化率分別為78.0 g/L和0.38 g/g，較出發菌株AJC分別提高21.9%、18.8%；副產物乳酸和L-谷氨酸積累量分別為0.11g/L、0.16 g/L，較出發菌株AJC分別降低96.8%、96.1%。選育生產穩定和產酸能力強的生產菌株具有巨大的工業生產應用潛力。