以丙酸鈣作抑菌劑制備獼猴桃酒工藝研究

周 文，舒學香，張崇軍，唐賢華

（1.四川工商職業技術學院，四川 都江堰 611830；2.四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都 610065）

獼猴桃發酵酒及其他果酒釀造過程中大多采用SO2作為抑菌劑，以防止雜菌生長從而造成發酵異常甚至產生毒素[1-4]，但SO2可能破壞人體的酶活力，影響人體新陳代謝，對肝臟造成一定的危害，SO2在酒中存在是對人體健康的一種潛在威脅，而且過量攝入會刺激呼吸道粘膜組織，進而誘發多種呼吸道炎癥[5]。因此其每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）為0～0.7mg/kg，我國國標GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》規定了SO2在果酒中的最高限量（≤0.25 mg/kg）[6]，然而在規定最大量的前提下，SO2在果酒中并不能充分的起到抗氧化及抗菌等作用[7-8]，所以尋找SO2的替代物是有必要的。

丙酸鈣具有一定的抗菌活性[9]，是一種常用的食品添加劑，在酸性條件下能夠抑制細菌和霉菌而對酵母菌無害，國標GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中為規定其在獼猴桃酒等果酒中的用量，但規定了在醬油、醋、面包等食品中的使用量不超過2.5 g/kg[6]，ADI不作限制性規定。本課題組前期研究發現在獼猴桃果漿中添加0.6 g/L丙酸鈣可以起到良好的抑菌效果，且安全性更高[10]。在此基礎上，進一步進行發酵工藝條件的優化，并對其進行理化指標測定，以及通過頂空固相微萃取氣質聯用（headspacesolidphase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）和香氣成分分析評價，以獲得一種風味優良且對人體危害小的獼猴桃發酵酒非常有必要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅陽獼猴桃（都江堰）：市售；丙酸鈣（食品級）：泰州市味香源食品添加劑有限公司；安琪葡萄酒高活性干酵母BV818：安琪酵母股份有限公司；偏重亞硫酸氫鉀、碳酸鈣（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；果膠酶、明膠（生化試劑）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

DHP-9162型電熱恒溫培養箱：上海齊欣科學儀器有限公司；GCMS-QP2010型氣相色譜質譜聯用儀、Essentia LC-16型液相色譜儀：日本島津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 獼猴桃酒制備工藝

獼猴桃漿果→分選→清洗去皮→打漿→添加果膠酶→添加抑菌劑→調整pH→接種酵母→前發酵→倒罐→后發酵→澄清→降酸→陳釀→過濾→獼猴桃酒

添加果膠酶：獼猴桃果漿初始糖度16.5°Bx，初始pH 3.47；果膠酶添加量100 mg/L，于40℃恒溫處理1 d；

添加抑菌劑：以丙酸鈣為抑菌劑添加量為0.6 g/L，以SO2（偏重亞硫酸氫鉀按50%SO2當量計）[11]為抑菌劑添加量為80 mg/L；

干酵母活化：活性干酵母中加入10倍含4%蔗糖的38℃溫水，活化30 min；

前發酵：接種后發酵至獼猴桃漿糖度5°Bx，結束前發酵進行轉罐后發酵；

后發酵：后發酵溫度15℃，時間15 d；

澄清：按30 mg/L的量向獼猴桃原酒中加入明膠；

降酸：用碳酸鈣降酸至5～6 g/L（酒石酸計）；

陳釀、過濾：4℃陳釀30 d，過濾后得獼猴桃酒成品。

1.3.2 發酵工藝優化

（1）單因素試驗

主發酵溫度優化：調整獼猴桃果漿pH至3.5，接種量0.08%，分別于18℃、20℃、22℃、24℃、26℃培養箱中進行主發酵，對制得的獼猴桃酒分別進行感官評分。

初始pH值優化：接種量0.08%，用檸檬酸或碳酸鈣分別調整初始pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，于24 ℃培養箱中進行主發酵，對制得的獼猴桃酒分別進行感官評分。

主發酵接種量優化：調整獼猴桃果漿pH至3.5，分別調整接種量為0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%，于24℃培養箱中進行主發酵，對制得的獼猴桃酒分別進行感官評分。

（2）響應面分析

在單因素試驗的基礎上，以感官評分為評價指標進行研究和分析，并確定3因素3水平的最佳參數進行響應面分析，各因素及水平編碼見表1。

表1 獼猴桃酒制備工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for kiwi fruit wine production technology optimization

1.3.3 感官評分標準

感官評分由5名專業人員按照表2中的評分標準進行，滿分100分，每個酒樣得分取5人平均值。感官評價方法參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行[12]。

表2 獼猴桃酒的感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of kiwi fruit wine

1.3.4 理化指標檢測方法

酒精度、總糖、總酸、SO2含量[12]測定：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定。

丙酸鈣含量測定[13]：參照GB 5009.120—2016《食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定》，采用液相色譜法測定。

1.3.5 HS-SPME-GC-MS條件[14-16]

樣品處理：取樣前先將萃取頭插入氣相色譜質譜聯用儀（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）進樣口，250℃老化2 h。將獼猴桃酒樣吸取5 mL裝入15 mL頂空瓶中，并迅速加入1.0 g NaCl，加蓋密封，置于40℃水浴鍋中平衡20 min。將老化好的萃取針插入頂空瓶，40℃水浴中萃取40 min后插入GC-MS進樣口，于250℃解吸5 min。

色譜條件：色譜柱KB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度250℃；程序升溫：初始溫度40℃保持2 min，以2℃/min的速率升溫至80℃后，以5℃/min的速率升溫至150℃后，再以10℃/min的速率升溫至250℃，保持5 min；以氦氣為載氣，流速1 mL/min，分流比1∶7。

質譜條件：電子轟擊離子源；離子源溫度280℃；電子能量70 eV；掃描范圍：30～450 u。

數據處理：采集到的質譜圖利用NIST08譜庫進行檢索，對各色譜峰按面積歸一化法進行相對定量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

根據試驗設計分別進行了發酵溫度、初始pH值、接種量對主發酵影響的單因素試驗，其結果分別如圖1～圖3所示。

由圖1可知，隨著發酵溫度的升高，獼猴桃酒的感官質量隨之提升，當溫度升至24℃時獼猴桃酒的質量最好，當溫度達到26℃時酒質又有所下降。其主要原因在于，當發酵溫度偏低時，酵母菌繁殖速度較慢，主發酵啟發時間延長，從而導致發酵時間延長，染雜菌機會增加，使獼猴桃酒發霉或酸度明顯增加。當溫度超過24℃時，由于酵母增殖快，導致衰亡速度增加，發酵中止快產酸增加[11]，同時高級醇等副產物增多，導致酒質下降。

圖1 發酵溫度對獼猴桃酒質量的影響Fig.1 Effect of main fermentation temperature on the quality of kiwi fruit wine

圖2 初始pH值對獼猴桃酒質量的影響Fig.2 Effect of initial pH on the quality of kiwi fruit wine

圖3 接種量對獼猴桃酒質量的影響Fig.3 Effect of inoculum on the quality of kiwi fruit wine

由圖2可知，初始pH值為3.5時發酵所得獼猴桃酒品質最佳，當初始pH值低于3.5時酵母菌的發酵作用受到了一定的抑制，且因為調酸加入了一定量的檸檬酸導致獼猴桃酒的酸度增加，口感變差。當初始pH值超過3.5時，隨著初始pH值的升高獼猴桃酒品質大幅下降，其主要原因在于，隨著初始pH值的升高丙酸鈣的抑菌效果急劇下降，在酸性條件下丙酸鈣游離產生的丙酸分子可穿透霉菌的細胞壁，抑制細胞內酶的活性，從而阻礙霉菌等雜菌的增殖[17]，初始pH值越低產生的丙酸分子越多，抑菌效果越好。當初始pH值達到5.0時可看到獼猴桃酒大量發霉。

由圖3可知，當接種量＜0.08%時，隨著接種量增加獼猴桃酒的品質逐漸變好，主要原因在于當接種量較低時，發酵初始階段酵母菌沒有占據發酵優勢，導致雜菌的生長，酒的品質變差。當接種量＞0.08%以后獼猴桃酒的質量趨于平穩且略有下降，其原因是接種量增大，發酵后期酵母死亡自溶增加，給獼猴桃酒帶來了一定的酵母味。

2.2 Box-Behnken響應面試驗

利用Deign-Expert8.0.6軟件進行了響應面試驗分析設計，其設計方案及結果如表3所示，回歸模型方差分析見表4。通過軟件對表3進行回歸擬合得到感官評分（R）與影響發酵3因素發酵溫度（X）、初始pH值（Y）、接種量（Z）的回歸方程：

R=90.8-0.063X-0.19Y+1.38Z-0.62XY-4.96X2-3.21Y2-1.59Z2

表3 獼猴桃酒發酵工藝優化Box-Behnken試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization of kiwi fruit wine

通過軟件對模型進行方差分析及回歸系數顯著性檢驗，其結果如表4所示。由表4可知通過響應面優化后得到的模型極顯著（P＜0.01），說明該模型可信。失擬項P=0.1985，影響不顯著（P＞0.05），復相關系數R2=0.980 6，僅有0.01%不能由該模型解釋，信噪比16.148＞4。綜合以上分析，可知該模型能夠很好的擬合試驗結果[18-20]。由表4可以看出，一次項中X（發酵溫度）、Y（初始pH）影響不顯著（P＞0.05），Z（接種量）影響極顯著（P＜0.01）；二次項X2、Y2、Z2均極顯著（P＜0.01）；交互項XY、XZ、YZ均不顯著（P＞0.05），說明影響發酵工藝的3個因素之間沒有明顯的交互作用。通過F值推斷試驗范圍內各因素對試驗結果影響的重要性，可知各因素對感官評價影響的主次順序是接種量＞發酵溫度＞初始pH。

借助Design-Expert 8.0.6軟件獲得主發酵溫度、初始pH和接種量對感官評分影響的三維響應面曲線，結果見圖4。根據軟件分析，可以得出以丙酸鈣作為抑菌劑制備獼猴桃發酵酒的最優工藝條件為發酵溫度23.99℃，初始pH3.49，接種量0.09%，在此條件下制備的獼猴桃發酵酒感官評分預測值為91.1。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

圖4 初始pH值、接種量以及發酵溫度交互作用對感官評分影響的響應面與等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of initial pH,inoculum and fermentation temperature on sensory score

2.3 響應面驗證試驗及理化指標分析

根據實際操作條件，將發酵條件調整為主發酵溫度24℃，初始pH3.5，接種量0.09%，在此條件下以丙酸鈣為抑菌劑（A）進行驗證試驗，同時對該條件下制得的獼猴桃酒進行了理化指標分析，并與同樣條件下以SO2為抑菌劑（B）制得的獼猴桃酒進行了對比分析，其結果如表5所示。

表5 最適條件下制得獼猴桃酒的理化指標分析Table 5 Physicochemical indexes analysis of kiwi fruit wine produced under optimal conditions

從表5可以看出，分別以丙酸鈣和SO2作為抑菌劑制得的獼猴桃酒具有相似的感官評分，且酒精度、總糖、總酸三個主要理化指標檢測結果相近。說明丙酸鈣可以替代傳統獼猴桃酒生產中使用的抑菌劑SO2，制得了獼猴桃酒具有相近的感官和理化性質，為獼猴桃酒的生產提供了一種新的方法和思路。以丙酸鈣為抑菌劑制得的獼猴桃酒中丙酸鈣含量為1.625g/kg，符合我國食品添加劑使用標準[6]中的要求。

2.4 香氣成分分析

采用頂空固相微萃取-氣相-質譜聯用技術（HS-SPMEGC-MS）分別對以丙酸鈣和SO2作為抑菌劑制得的獼猴桃酒進行香氣成分分析，其總離子流色譜圖如圖5所示。

從圖5可以看出，不同的獼猴桃酒揮發性風味成分的GC-MS總離子圖譜極其相似，香氣成分的出峰時間幾乎完全相同，說明兩種獼猴桃酒的揮發性風味成分組成差異不大，由此表明使用不同的抑菌劑對獼猴桃酒揮發性風味成分組成影響不大。采用面積歸一化法，對檢測到的主要香氣成分對應峰進行定量分析，其結果如表6所示。

圖5 不同抑菌劑制得獼猴桃酒的香氣成分的GC-MS總離子流圖Fig.5 Total ions chromatogram of aroma components of kiwi fruit wine produced by different bacteriostats by GC-MS

表6 不同抑菌劑制得獼猴桃酒的香氣成分對照Table 6 Comparison of aroma components of kiwi fruit wine produced by different bacteriostats

從表6可以看出，兩種獼猴桃酒的揮發性風味成分組成類似，兩者的共有成分有9種，其中以酯類物質為主，大多數酯類具有令人愉悅的香氣，對構成獼猴桃酒的典型香氣有重要作用[21-22]，如辛酸乙酯具有令人愉快的花果香氣、杏子香氣，癸酸乙酯具有葡萄的水果香氣[23]。以丙酸鈣為抑菌劑制備的獼猴桃酒丙酸乙酯、3-甲基丁酸、苯乙醇、苯甲酸甲酯、2-乙基苯酚、苯甲酸乙酯的含量更高一些，特別是丙酸乙酯增加較多，其主要原因在于丙酸鈣溶解于酸性溶液中生成丙酸，丙酸與酵母菌發酵產生的乙醇發生酯化反應而生成大量丙酸乙酯，丙酸乙酯具有菠蘿香味，可用作食品加香劑，GB 2760—2014規定為允許使用的香料，常用作于配制朗姆酒、白酒、菠蘿型香精等。兩種酒的揮發性風味成分含量不同，說明使用不同的抑菌劑制備獼猴桃酒對酒的風味具有一定的影響。

3 結論

通過單因素試驗和響應面試驗優化得出，以丙酸鈣作為抑菌劑制備獼猴桃發酵酒的最優工藝條件為發酵溫度24℃，初始pH值為3.5，接種量0.09%。在此優化條件下，實際驗證獼猴桃發酵酒的感官評分為91.5分。

以丙酸鈣為抑菌劑在最優工藝條件下制得的獼猴桃酒與以SO2為抑菌劑制得的獼猴桃酒相比較，在酒精度、總糖、總酸三個主要理化指標檢測結果相近，說明丙酸鈣可以替代傳統獼猴桃酒生產中使用的抑菌劑SO2。通過香氣成分比較發現，兩種獼猴桃酒主要揮發性風味成分組成類似，由于丙酸鈣的添加使獼猴桃酒中丙酸乙酯大量增加，不同抑菌劑制得獼猴桃酒的揮發性風味成分含量有差別導致風味存在一定差別。

以丙酸鈣為抑菌劑制得的獼猴桃酒中丙酸鈣含量為1.625 g/kg，達到了我國食品添加劑使用標準中的要求，說明用此法生產獼猴桃酒是安全可行的。