L-苯丙氨酸對蘋果醋發酵乙酸-2-苯乙酯合成途徑的影響

宋 娟，張霽紅，康三江*，張海燕，曾朝珍，袁 晶，張 芳，黃玉龍

（甘肅省農業科學院 農產品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070）

蘋果醋是以蘋果汁或渣作為原料，經過酒精發酵和醋酸發酵后獲得[1]，再加以調制成有獨特蘋果香氣的醋飲料[2-3]。由于蘋果品種差異、菌種老化、加工工藝單一等原因，導致追求蘋果醋制品多樣化的同時，卻引起果醋香氣等品質的下降。

L-苯丙氨酸是一種符合現代食品工業綠色安全標準的食品添加劑[4-5]，主要是微生物通過從頭合成途徑和艾氏途徑將L-苯丙氨酸轉化為β-苯乙醇[6]。許多發酵產品在發酵過程中由微生物自然形成具有風味和香氣的酯類化合物，大多數酵母菌能產生雜醇油，而β-苯乙醇是雜醇油的重要組成部分，具有玫瑰香味；乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）是醋酸發酵的關鍵酶，該酶是膜結合蛋白，與醋酸菌的膜結合影響醋酸菌的乙醇轉化率和醋酸菌的產酸率[7]；乙酸-2-苯乙酯是酵母菌發酵產品的主要的特征性香氣成分，具有甜蜜香味[8-9]，已有研究發現其合成途徑有兩條[10-12]：（1）在酯酶（esterase）的作用下由乙酸和β-苯乙醇合成；（2）在醇酰基轉移酶（alcohl acyltransferaes，AAT）的作用下由乙酰輔酶A和β-苯乙醇形成。目前，國內外學者主要采用不同處理方式如超聲[13]、微波[14]，調控氮源濃度[15]，不同特性的酵母菌種共發酵[16]，生物酶解技術[17]等方法提高乙酸苯乙酯等酯類物質的含量。在紅曲黃酒釀造中發現乙酸-2-苯乙酯是在后續發酵過程中酵母通過酯合成[18]，主要是酯酶合成途徑[19]；蘋果酒酵母代謝中乙酸苯乙酯主要由AAT催化合成[10]，且AAT對乙酸苯乙酯的合成具有特異性[20]，STRIBNY J等[21]也同樣提出葡萄酒釀造中AAT具有底物特異性。然而，在蘋果醋發酵過程中，L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其關鍵酶活的影響還未見相關研究。

本試驗在該課題前期研究[22-23]的基礎上，采用頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜聯用（headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）和酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），初步分析食品添加劑L-苯丙氨酸對蘋果醋中合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質和關鍵酶活的影響，為蘋果醋制品香氣成分和風味物質的代謝調控提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蘋果（“長富二號”紅富士）：甘肅慶陽。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1750、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）CICC20056：中國工業微生物菌種中心。

1.1.2 培養基[24]

基礎培養基：10 g/L葡萄糖，10 g/L酵母粉，pH 4.5。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母粉。

轉化培養基：60g/L葡萄糖，6g/L蛋白胨，0.5g/LMgSO4，5 g/LKH2PO4，分別添加0、2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L的L-苯丙氨酸，自然pH值。上述培養基滅菌條件均為121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學試劑

氫氧化鈉（粒）、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂、無水乙醇、碳酸鈣、MgSO4、KH2PO4（均為分析純及生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；果膠酶（＞50 000 U/g）：上海源聚生物科技有限公司；乙酸、乙醇、β-苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯（色譜純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3-辛醇（色譜純）（67.396 mg/L）：美國Sigma公司；L-苯丙氨酸（98.5%）：上海生工生物公司股份有限公司；乙酰輔酶A/ADH/AAT/Esterase ELISA試劑盒：北京冬歌生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S-CW電子天平：上海賽多利斯貿易有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；ZHJH-C1112B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；PZJ-0.5型榨汁機：江蘇科威機械有限公司；LRH-250生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；TRACE 1310-ISQ-LT氣相色譜-質譜聯用儀、三重四級桿氣質聯用儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；Synergy H1酶標儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

吸取0.5 mL基礎培養基溶解菌粉，菌懸液轉移至盛有5 mL液體培養基的試管中，24℃（CICC1750）/28℃（CICC 20056）恒溫培養；劃線制備活化的酵母菌，按8%接種于轉化培養基，120 r/min、24 ℃培養48 h，備用。

1.3.2 蘋果醋加工工藝流程

富士蘋果→挑選、清洗、榨汁→蘋果汁、渣分離→果膠酶處理蘋果汁→接種酵母菌液（酒精發酵）→接種醋酸菌（醋酸發酵）→陳釀→蘋果醋

操作要點：采用0.8%果膠酶（酶活＞50000U/g）處理蘋果汁（降低果汁黏稠度，提高出汁率和澄清度）；接種8%CICC1750酵母菌液，24℃條件下酒精發酵，當酒精體積分數不增加、糖度不降低時結束酒精發酵；接種10%CICC20056醋酸菌液，28℃條件下醋酸發酵，當醋酸濃度不再升高時結束醋酸發酵。將醋酸發酵后的蘋果醋放入密閉容器中，控制溫度在18～25℃之間，靜置3個月以上完成陳釀過程。

1.3.3 測定方法

（1）揮發性物質的測定[25-26]

頂空固相微萃取法：樣品前處理采用SPME法處理，分別取5 mL樣品加入50 μL 3-辛醇內標，漩渦混勻，裝入15 mL頂空瓶中，樣品由TriPlus RSH Autosampler-SPME系統處理，萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。萃取條件：60.0℃吸附40 min。保溫5 min。外標標準品母液1 000 mg/L，100 mL純乙醇＋0.1 g外標（乙酸、β-苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯），外標測試樣品準備A液10 mL（體積分數4%乙醇溶液）＋10 μL待測母液，樣品瓶5 mL＋50 μL 3-辛醇內標。

氣相色譜（GC）條件：進樣口溫度25℃，載氣氦氣（He），流速1.2 mL/min。進樣量1 μL，分流進樣，分流比40∶1。色譜柱為DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升溫程序40 ℃恒溫2min，以5℃/min升至180℃，然后從15℃/min升至230℃，5 min。

質譜（MS）條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度200℃，接口溫度250℃。掃描范圍33.00～350.00 u。

（2）乙酰輔酶A、ADH、AAT、Esterase酶活性的測定[27]

采用ELISA試劑盒檢測樣品中的乙酰輔酶A、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、AAT、酯酶活性。酶標儀測定450 nm波長處各孔的OD450nm值，計算樣品濃度。

（3）酒精度[28]：以乙醇計，GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》，密度瓶法測定。

1.3.4 感官評價[29]

以不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋為基礎原料，加入蔗糖、蛋白糖、濃縮蘋果汁等，調配成蘋果醋飲料，經過均質、預熱、灌裝、密封，在95℃下保持10 min滅菌處理，冷卻得到成品，組織30名品評人員，按表1的內容分別從色澤、香氣、滋味和組織形態共四個方面進行評定并打分（滿分100分計）。

表1 蘋果醋飲料制品的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of apple vinegar beverages

1.3.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 19.0軟件進行統計分析、采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 L-苯丙氨酸對乙酸-2-苯乙酯合成途徑的影響

2.2.1 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯相關基質濃度的影響

L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質濃度的影響結果見圖1。由圖1可以看出，隨著L-苯丙氨酸添加量的增加，β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A和乙酸-2-苯乙酯生成量均比對照樣（不添加L-苯丙氨酸）的高，說明L-苯丙氨酸有明顯的誘導乙酸-2-苯乙酯合成及其相關基質生成量積累的作用，具有劑量依賴性。和對照樣相比，當L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時，β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A、乙酸-2-苯乙酯的濃度均達到最大值，分別增加了19.2%、35.9%、10.86%、51.6%。當L-苯丙氨酸添加量＞8g/L時，合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質生成量都出現下降的現象，可能是發酵過程中代謝物的高濃度蓄積，存在產物抑制效應，抑制了微生物生長，導致發酵代謝物產量下降。因此，初步將8 g/L作為L-苯丙氨酸的最佳添加濃度。該添加量條件下更有利于增加蘋果醋發酵中特征性香氣成分乙酸-2-苯乙酯的生物合成，對合成乙酸-2-苯乙酯的醇酰基轉移酶途徑和酯酶途徑均有一定的影響。

大多數研究表明，L-苯丙氨酸質量濃度為5～10 g/L時為最佳底物濃度范圍[30]，8 g/L L-苯丙氨酸最佳添加量，對β-苯乙醇轉化量的影響與牛明福等[24]的研究結果是一致的，而其對乙酸、乙酰輔酶A和乙酸-2-苯乙酯生成量的影響還未見相關報道。

圖1 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質濃度的影響Fig.1 Effect of L-phenylalanine on the synthesis of acetic acid-2-phenyl ethyl ester and its related matrix concentration

2.2.2 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關鍵酶活性的影響

L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關鍵酶活性的影響結果見圖2。由圖2可知，和對照樣（不添加L-苯丙氨酸）相比，隨著L-苯丙氨酸添加量的增加，ADH和AAT酶活性出現不同程度的增加，然而酯酶活性明顯降低。其中，隨著L-苯丙氨酸添加量的增加，蘋果醋發酵液的ADH酶活均比對照樣的高，說明L-苯丙氨酸對ADH酶活有明顯誘導作用，可以誘導酒精發酵產生的乙醇轉化為醋酸，L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時，ADH酶活達到最大值，比對照樣提高30.98%（P＜0.05）；和對照樣相比，L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時，AAT酶活達到最大值，而低濃度的L-苯丙氨酸對AAT酶活沒有明顯的誘導效果。因此，8 g/L的L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關鍵酶ADH、AAT的酶活性均有一定的促進作用，推測L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時，可以通過醇酰基轉移酶途徑促進乙酸-2-苯乙酯的合成，這與8 g/L的L-苯丙氨酸使得合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質（β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A）生成量的達到最大值的數據結果一致。但是，不同濃度的L-苯丙氨酸處理的蘋果醋發酵液中酯酶活均比對照樣的低（P＜0.05），說明L-苯丙氨酸對蘋果醋發酵液的酯酶活卻有一定的抑制作用，由于酯酶是可逆酶，可能是酯酶代謝途徑太長，支路太多，L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯的酯酶途徑影響的機理有待深入研究。

圖2 L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯關鍵酶活性的影響Fig.2 Effects of L-phenylalanine on key enzymes activities in the synthesis of acetic acid-2-phenyl ethyl ester

2.3 蘋果醋飲料感官評價

不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲品的感官評價結果見表2。從表2的感官評價結果可以看出，對不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料制品屬于中上等級，其中8 g/L的L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料感官評價最優，具有較濃厚的香氣和風味。

表2 不同添加量L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料制品的感官評價Table 2 Sensory evaluation of apple vinegar beverages treated with different L-phenylalanine addition

3 結論

在蘋果醋發酵過程中，初步發現食品添加劑L-苯丙氨酸對合成乙酸-2-苯乙酯及其相關基質的生成量和關鍵酶活性有一定的影響。當L-苯丙氨酸添加量為8 g/L時，β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A、乙酸-2-苯乙酯的質量濃度分別提高了19.2%、35.9%、10.86%、51.6%，且不同添加量的L-苯丙氨酸有明顯誘導乙酸-2-苯乙酯合成及其相關基質生成量積累的作用，具有劑量依賴性；同時，L-苯丙氨酸可以誘導ADH將乙醇轉化為醋酸、催化β-苯乙醇和乙酰輔酶A通過醇酰基轉移酶途徑生成乙酸-2-苯乙酯，卻對酯酶活性有抑制作用，不利于乙酸-2-苯乙酯通過酯酶途徑進行生物合成。綜合考慮，初步推測將8 g/L作為L-苯丙氨酸的最佳添加量，通過醇酰基轉移酶途徑促進乙酸-2-苯乙酯的合成及其相關基質（β-苯乙醇、乙酸、乙酰輔酶A）的生成量和關鍵酶ADH、AAT的酶活性，經感官評價得出8 g/L L-苯丙氨酸處理的蘋果醋飲料制品能較好的滿足消費者的需求，為高品質蘋果醋的技術研究和指導生產實踐提供一定的理論依據。