香梨發酵酒發酵工藝的優化及其香氣成分研究

賈 娟，王婷婷，楊雯雯，王德良

（1.河南工業大學 漯河工學院，河南 漯河 462002；2.漯河職業技術學院，河南 漯河 462002；3.中國食品發酵工業研究院，北京 100015）

果酒是以用水果為原料經過破碎、壓榨取汁、發酵和調配等工藝釀造而成的低度飲料酒[1-2]。目前，果酒的品種逐漸增多（如菠蘿酒、獼猴桃酒、西瓜酒、草莓酒、火龍果等[3-7]），對各種果酒的探究引起了不少研究者的興趣。

梨在中國分布較廣，被營養學家譽為“功能食品”，其品種有很多，最具有代表性的是香梨。香梨味道濃郁、皮薄、肉細、汁多甜酥、清爽可口，系梨之上品；此外，香梨還具有調節人體新陳代謝、促進血液循環、保護心臟、減輕疲勞、增強心肌活力、降低血壓等多種功效[8]。河南省是梨果生產大省，主要的品種有酥梨、香梨、水晶梨、雪花梨、豐水梨等，品種多產量大，尤其是在豐收年，梨的價格低、銷售困難等因素。如果把梨加工成梨酒不僅能解決這一矛盾，而且能提高梨資源的利用率，拓寬果酒釀造的方向，具有較好的市場前景。

本試驗對河南平頂山香梨果酒生產工藝進行了研究，通過單因素和響應面試驗優化確定最佳發酵工藝條件，采用頂空-固相微萃取（head-space solid phasemicroextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜聯用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析[9-10]，對其香氣成分進行定量分析，為其精深加工和梨酒的品質鑒定提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香梨：河南平頂山；果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖（食品級）：漯河市農貿市場；異抗壞血酸鈉：鄭州拓洋實業有限公司；偏重亞硫酸鉀：意大利拉曼公司；檸檬酸：濰坊美軒實業有限公司；EX-V果膠酶（10萬U/g）：曼森商貿有限公司；NaOH（分析純）：上海禹泰化工有限公司。

1.2 儀器與設備

SCION SQ 456氣相色譜-質譜聯用儀：美國布魯克·道爾頓公司；手動固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）裝置（15mLSPME，100μm聚二甲基硅烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取頭，手柄）；HR1871Philips Avance系列榨汁機：飛利浦電子香港有限公司；SHHW21.600A（I）電熱恒溫水溫箱：廣州市典銳化玻實驗儀器有限公司；XSE105DU電子稱：深圳市盛美儀儀器有限公司；LHP-250型恒溫恒濕培養箱：上海三發科學儀器有限公司；WYT型手持式糖量計折射儀：北京紫金光儀器有限公司；PHS-2C型酸度計：上海智光儀器儀表有限公司；721型分光光度計：上海天普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香梨果酒工藝流程及操作要點

選擇新鮮成熟的香梨，清水洗凈后去皮、去核、切塊、榨汁，過濾可得澄清梨果原汁。在梨果原汁加入（按梨汁質量）焦亞硫酸鉀0.03%、異抗壞血酸鈉0.07%和檸檬酸0.03%溶液進行護色[11]。護色后的梨汁加入3‰果膠酶混勻，酶解溫度40℃，時間為5 h。用8層紗布過濾，得到梨汁備用。添加蔗糖調整梨汁糖度為19%，添加檸檬酸調整梨汁初始pH值。稱取20 g酵母，加入5%糖水無菌水稀釋至100 mL，37～38℃攪拌活化15～20 min得0.2 g/mL酵母活化液。將梨汁倒入容器內，裝液量80%，加入一定量的活化酵母，攪拌均勻后，在一定溫度條件下進行酒精發酵，每天攪拌1～2次，發酵7 d，用120目濾布過濾得梨酒。最后將梨酒進行澄清后進行巴氏殺菌（65℃、30 min）。

1.3.2 香梨果酒發酵條件的單因素試驗設計

初始pH值：分別調整梨汁初始pH值為3.0、3.2、3.4、3.6、4.0，在酵母添加量為0.3%的條件下，26℃恒溫培養箱中靜置培養，發酵7 d后，以酒精度和感官評定來確定最適初始pH值。

酵母接種量：調整梨汁初始pH值為3.5，分別將酵母添加量調整為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，置于26℃恒溫培養箱中靜置培養，發酵7 d后，以酒精度和感官評定來確定最適酵母接種量。

發酵溫度：調整梨汁初始pH值為3.5，將酵母添加量調整為0.3%，分別在發酵溫度為16℃、19℃、22℃、25℃、28℃的恒溫培養箱中靜置培養，發酵7 d后，以酒精度、和感官評定來確定最佳發酵時間。

1.3.3 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken中心組合設計原理，以初始pH值、酵母接種量、發酵溫度為考察因素，以梨酒酒精度（Y）為響應值，利用Design Expert 8.0.6軟件進行3因素3水平的響應面分析[12]，建立數學模型，以獲得梨酒最佳制作工藝條件，試驗因素水平編碼如表1所示。

表1 香梨酒發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of fragrant pear wine

1.3.4 測定方法[13-14]

酒精度測定：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；糖度測定：采用手持測糖儀測定；pH測定：采用酸度計測定；微生物檢測按《食品衛生微生物學檢驗標準》（GB/T 4789—2008）的相應方法執行。

產品的綜合評價：隨機選定具有一定代表性的學生20名，逐一品嘗各配方組合，并分別進行評分，再統計每個組合的果酒品質綜合評定。感官評價標準見表2。

表2 香梨果酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of fragrant pear wine

香梨果酒香氣成分的GC-MS分析：按照參考文獻[14]的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 香梨果酒生產工藝的單因素試驗

2.1.1 初始pH值的確定

發酵液的酸堿程度對酵母的生長和代謝產物的形成具有一定得影響。不同的酵母都有其最適合的生長范圍。過高或過低都會抑制酵母體內酶的活性，使得酵母細胞的代謝受到阻礙，從而影響酒精的產量[15]。

圖1 初始pH值對香梨果酒酒精度和感官評分的影響Fig.1 Effect of initial pH on alcohol content and sensory score of fragrant pear wine

由圖1可知，隨著初始pH值的升高，酒精度及感官評分均呈先增加后降低的趨勢，當初始pH值為3.4時，酒精度及感官評分均達到最高，主要原因是初始pH值過低時，酵母產生酒精的量較少，發酵原液的糖類沒有轉換成酒精，當pH＞3.6時，發酵酒的口感粗糙，味道略微帶酸，因此選擇梨汁初始pH值為3.4較好。

2.1.2 酵母接種量的確定

接種量與發酵周期有直接關系。酵母接種量對香梨果酒酒精度和感官評分影響見圖2。

圖2 酵母添加量對香梨果酒酒精度和感官評分的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of fragrant pear wine

由圖2可知，隨著酵母接種量的增加，酒精度及感官評分均呈先增加后降低的趨勢。當接種量為0.3%時，香梨果酒的酒精度及感官評分均達到最高。這主要是酒精的產出量隨酵母接種量的增加而增大，當酵母添加量過低時，則發酵慢，料液中的糖不能完全被酵母利用，產生酒精度低[16]；接種量過大時，酵母相互之間抑制生長，導致酒精量減少，也易產生酵母異味[17]。因此選擇酵母接種量為0.3%較好。

2.1.3 發酵溫度的確定

發酵溫度對梨酒酵母菌的生長有很大的影響，酵母接種量對香梨果酒酒精度和感官評分影響見圖3。由圖3可知，隨著溫度的升高，酒精度及感官評分均呈先增加后降低的趨勢。溫度升高時，發酵速度加快；如溫度過高，酵母菌生長速度較快，容易衰老，不能在發酵后期將發酵液中的糖有效轉化成酒精[18]，會影響產酒精量，而且酒體粗糙，酒質容易氧化，感官評分也隨著溫度的升高而有所下降。當發酵溫度為25℃時，酒精度和感官評分都達到最高。KILLIAN E等[19]的研究結果也認為，較低的發酵溫度有利于改善果酒的質量，這主要是因為發酵溫度升高會使果香揮發、氧化損失加大，還會引起高級醇、揮發酸、醛類等副產物的增加，使酒的風味劣變綜合考慮，因此選擇發酵溫度為25℃較好。

圖3 發酵溫度對香梨果酒酒精度和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of fragrant pear wine

2.2 香梨果酒發酵條件響應面優化試驗

利用Design-expert8.0.6軟件對表3進行數據分析，得到感官評分Y與自變量X1、X2、X3的二次回歸方程為Y=94.20+2.48X1-0.89X2+2.31X3-0.075X1X2+0.22X1X3-0.65X2X3-8.25X12-2.38X22-5.62X32

對以上響應面回歸模型進行方差分析，結果見表4，建立的數學模型，回歸模型F=77.55，P＜0.000 1表明香梨果酒的酒精度評分與3個因素之間的回歸方程極顯著。因變量與所考察自變量之間的線性關系顯著（R2=0.990 1），調整確定系數R2Adj=0.977 3，說明可解釋97.73%相應值得變化，模型失擬項0.167 9＞0.05，不顯著，擬合程度好，表示單因素試驗結果可以和數學模型模擬良好。表4中的一次項X1、X3及二次項X12、X22、X32的值均＜0.01，達到極為顯著水平，說明它們對響應值影響極大，且考察的因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。由F值大小可知，影響因素的主次順序是：X3＞X1＞X2。

表3 香梨果酒發酵工藝優化響應面試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation process optimization of fragrant pear wine

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

3個因素交互作用對香梨果酒感官評分影響的響應曲面及等高線見圖4。由圖4可知，在試驗所選擇的水平范圍內，因素之間交互作用對香梨果酒的感官評分的影響相似，都隨著各交互因素添加量的增加達到最大值后又降低，X1X2、X1X3、X2X3之間有一定交互作用，但是其交互用對感官評分影響相對較小。

圖4 初始pH值、發酵溫度及酵母添加量間交互作用對香梨果酒感官評分影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH,fermentation temperature and yeast inoculum on sensory score of fragrant pear wine

2.3 回歸模型的驗證試驗

為了驗證響應面預測得出的最佳工藝參數，按照初始pH值、酵母添加量、發酵溫度分別為3.5，0.3%，25.2℃，進行3次平行驗證試驗，最終感官評分的平均值為94.4分，與預測值94.7較接近，在此條件下測定的酒精度為10.5%vol。說明該模型能很好地預測香梨果酒發酵條件與感官評分的關系。

2.4 香梨果酒發酵工藝風味物質分析結果

按照本釀造工藝所得到的香梨果酒香氣成分通過GC-MS分析，詳細的鑒定結果見表5。

表5 香梨果酒香氣成分的GC-MS鑒定結果Table 5 Identification results of aroma components in fragrant pear wine by GC-MS

續表

通過GC-MS分析得出，共鑒定出68種香梨果酒的香氣成分，占總香氣成分的99.547%。從表1可以看出，香梨果酒香氣物質主要包括酯類24種、醇類10種、醛類8種、酸類8種、酮類5種、萜烯類2種、烷烴類2種，酚類1種和6種其他類化合物。其中酯類物質占香氣成分的48.395%；醇類物質占香氣成分的31.569%；醛類占香氣成分的2.187%；酸類占香氣成分的4.904%；萜烯類占香氣成分的3.124%。

鑒定出的酯類化合物共有24種，是含量最多的香氣成分，對香梨果酒的獨特風味有重要的影響。一般認為酯類化合物形成途徑是酵母的生物合成。其中檢測出的乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯和乙酸異戊酯含量都較高，其分別代表較強的酒香氣味；桔子或葡萄香味[20]；類似水果香味的香味；蘋果、櫻桃的水果香氣；香蕉、草莓果香[21]；香蕉香、甜香、蘋果香、水果糖香[22]，酯類化合物主要賦予果酒怡人的果香氣，可以使酒體變得果香濃郁、酒香醇和香氣協調。鑒定出的醇類化合物共有10種，醇類物質含量僅次于酯類揮發性風味化合物，在不同風味成分轉化中有重要作用，對香梨果酒的風味形成有重要的貢獻[23]。果酒中的醇類化合物有異戊醇、正己醇、2,3-丁二醇、苯乙醇等化合物，它們分別代表水果香、花香[20]；青草味[20]；酒香[21]花香、水果香、甜香[20]。這些醇類物質是由原料中的蛋白質和糖類通過酵母的發酵作用，降解成的各種醇類化合物。研究表明[24]，少量的高級醇是果酒重要的風味物質，適量的高級醇賦予酒體優雅的香氣的感官特性，同時這些物質又是其他香氣物質的良好溶劑，它們的嗅覺一般都很低，所以香氣值很高，對總體香氣的形成有不可忽視的作用。

鑒定出酸類化合物8種，主要是對香梨果酒的口感和后味，但其閾值較高，對果酒的香氣貢獻起到助香、減少刺激和緩沖平衡的輔助作用[25]。分別鑒定出醛類、酮類8種和5種，這些成分對果酒品質有重要貢獻[26-27]，另外在香梨果酒中鑒定出萜烯類物質如萜品油烯和α-法尼烯，其中α-法尼烯是一類具有較強香氣和生理活性的天然化合物[28]。研究表明該類物質也能對梨酒果酒的清香起到一定作用。

3 結論

本研究通過單因素及響應面試驗得到香梨果酒的最佳發酵條件為初始pH值3.5、酵母添加量0.3%、發酵溫度25.2℃，在此條件下，香梨果酒的感官評分為94.4分，酒精度為10.5%vol。香梨果酒呈現淡金黃，澄清透明，均勻一致；酒體舒適并有香梨味柔和；醇香濃郁、性質穩定。從香梨果酒中共鑒定出香氣物質68種，占總香氣成分的99.547%，其中相對含量較高的香氣物質為乳酸乙酯11.938%、乙酸異戊酯1.167%、己酸乙酯4.414%、乙酸己酯2.092%、辛酸乙酯11.754%、丁酸乙酯9.039%、異戊醇12.689%、正己醇4.299%、2,3-丁二醇6.005%、苯乙醇3.357%、苯甲醛2.008%。綜合評價出平頂山香梨酒中的特征香氣物質，為河南平頂山香梨酒提供理論依據。