不同菌株對酸奶品質與感官特性的影響

劉文文，張靖晞，李 鍵，索化夷*

（1.西南大學 食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學 食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400715；3.西南民族大學 生命科學與技術學院，成都 610041）

隨著人民生活水平的提高，人們對身體健康和營養的要求也越來越高。作為具有代表性的乳制品之一，酸奶種類繁多[1]。酸奶的品質受多方面因素影響（如原料、添加劑、發酵劑、發酵溫度及時間、貯藏條件等），其中酸奶發酵劑是酸奶產品產酸和產香的基礎和決定因素。復合酸奶發酵劑是由多種乳酸菌株共同組成的，這些菌株以不同比例共生在同一個微生態環境體系中，反復著互相促進和拮抗的關系，形成了酸奶的微生物菌群[2]。微生物菌群不同，其產生的代謝活性物質和抗菌物質也不同，直接影響酸奶的質地和風味。劉慧等[3]用復合開菲爾發酵劑制作的成品酸奶較市售酸奶凝乳時間短，組織凝固狀態結實，風味較好且口感細膩，酸度適中，且有濃郁的酯香風味。蘇敦等[4]用不同發酵特性的2株嗜熱鏈球菌、1株保加利亞乳桿菌和1株嗜酸乳桿菌，通過對單菌和復配菌發酵乳的感官分析，得到了6組優化的含4株菌的發酵劑配方。

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是酸奶生產中最常用到的兩種乳酸菌菌種[5]。保加利亞乳桿菌具備良好的耐酸性和蛋白質水解特性，可以發酵己糖產生乳酸和一些羰基化合物，如通過丙酮酸代謝產生乙醛，乙醛是酸奶中最具有代表性的芳香物質。保加利亞乳桿菌還可以水解蛋白質為嗜熱鏈球菌提供肽類以供其生長[6]。隨著研究不斷深入，越來越多的酵母菌屬被從以牦牛酸奶為首的各種乳制品中分離檢測出來，如開菲爾酸奶[7]、中國酸馬奶[8]、西藏曲拉[9]、川西北地區的牦牛酸奶[10]等。酵母菌可消耗對乳酸菌細胞生長有抑制作用的副產物乳酸鹽，更利于乳酸菌生長[11-13]。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的發酵過程對凝結芽孢桿菌有協同和促進成型的作用[14]。干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌是能夠耐受有機體的防御機制的益生菌，因而備受關注，將這兩種菌應用于酸奶發酵中，能調節腸內菌群平衡且促進人體吸收。

因此，本研究將不同發酵特性的優良菌株進行組合對酸奶進行發酵，以期提升發酵劑的整體性能，為新型酸奶的研究和生產提供理論參考并奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用菌株：從自然發酵牦牛酸乳中分離純化，本實驗室保存；開菲爾乳桿菌（Lactobacillus kefiri）700、酵母菌（Saccharomyces）Y18、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）N14、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）L16、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）GL2、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）GL6。

1.1.2 原料和試劑

純牛奶：中國蒙牛乳業（集團）股份有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）、L-谷氨酸鈉、甲醇（色譜純）：成都市科龍化工試劑廠；蘋果酸標準品、乳酸標準品、乙酸標準品、檸檬酸標準品（均為色譜純）：北京索萊寶科技有限公司；MRS液體培養基、MRS固體培養基：青島高科園海博生物技術公司。

1.2 儀器與設備

H2050R臺式高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；CT3 25K質構儀：美國Brookfield博勒飛公司；SWCJ-2F潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；DGG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；FA2004電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與凍干粉的制備

將冷凍保存的菌株以6%的接種量接種至液體培養基傳3代進行活化，將第3代的菌培養液4000r/min離心10min，棄上清液后，加入0.9%無菌生理鹽水多次洗滌，棄上清液，按照菌懸液∶脫脂乳保護劑=10∶1（V/V）的比例向菌泥中加入適量經滅菌處理的脫脂乳保護劑，置于-80℃溫度條件下預冷6h后，使用真空冷凍干燥機對其進行冷凍干燥20h，得到各個菌株的凍干菌粉，熔封，置于-20℃溫度條件下保藏。

1.3.2 凍干菌粉的活菌計數

參考GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》[15]中菌落總數測定的方法加以調整后測定，對6種菌粉的菌落數進行計數，單位為CFU/g。

1.3.3 酸奶的制備

制作流程：50 mL配料（純牛奶、8%白砂糖）經殺菌后（95℃、15 min）冷卻至室溫后倒入相應的菌粉，按照10%接種量進行接種。發酵至凝乳后（發酵溫度37℃），放入4℃冰箱中進行后熟。所接菌種組合分別編號為組1（N14∶L16=1∶1）、組2（N14∶L16∶GL2=1∶1∶1）、組3（N14∶L16∶GL6=1∶1∶1）、組4（N14∶L16∶700=1∶1∶1）、組5（N14∶L16∶Y18=1∶1∶1）；用5組發酵劑組合所發酵的酸奶編號分別為組1（LS）、組2（LSGL2）、組3（LSGL6）、組4（LS700）、組5（LSY18），以市售酸奶（TY）為對照。

1.3.4 酸度測定

依照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準乳和乳制品酸度的測定》[16]中酸度測定的方法，每組酸奶測定3次，計算平均值，結果保留一位小數。

1.3.5 質構分析

采用CT3 25K型質構儀對酸奶進行質構分析（texture profileanalysis，TPA）。設定參數如下：探頭型號TA25/1000；平端直徑50 mm；測試前探頭下降速度10.0 mm/s；測試速度1.0 mm/s；測試后探頭回程速度1.0 mm/s；時間5.00 s；測試距離15.00 mm；觸發力5 g。

測定指標：第一循環硬度、粘力、彈力、膠著力。每組酸奶均測定3個平行。

1.3.6 有機酸的測定

采用高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）對酸奶中的有機酸進行定量分析。色譜條件：Agilent XDB-C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；檢測溫度：35℃；流動相：0.01 mol/L磷酸二氫銨緩沖溶液（pH=2.8）和甲醇（95∶5，V/V）；流速：0.6 mL/min；進樣量：10 μL；最大柱壓：1 500 Pa；可見光-紫外吸收檢測器，檢測波長：215 nm。

1.3.7 感官評價分析

建立感官評價小組：在感官分析實驗室里，根據GB/T 16291.1—2012《感官分析選拔、培訓與管理評價員一般導則》[17]中提到的方法開展感官能力、感官靈敏度和描述能力的測試，篩選人員后進行感官分析基礎知識、識別及標度的使用等感官描述性分析專項培訓。通過該培訓具有合格資格的8名評價員組成酸奶的感官評價小組。

建立酸奶感官描述詞：參考KOPPEL K等[18-19]建立感官描述詞的方法，根據MARISSSA M D等[20-21]建立的酸奶感官描述詞和參照物，整理出候選的酸奶感官描述詞，并將其與參照物、樣品一起呈送給感官評價小組。參照GB/T 10221—2012《感官分析術語》[22]選取適當的參照物，再由評價小組討論達成一致的采用0～15（0.5增量）的標度法來表示參照物強度。感官評價指標相應參比見表1。

表1 酸奶感官描述詞匯Table 1 Sensory description vocabulary of yoghurt

1.3.8 數據處理

采用Microsoft Excel（2010）版軟件制作蘋果酸、乙酸、檸檬酸、乳酸各自的標準回歸曲線并得出相應曲線方程、R2、RSD。應用XLSTAT 2016軟件對酸奶的感官特征進行主成分分析（principle component analysis，PCA）和聚類分析（agglomerative hierarchical clustering，AHC）。

2 結果與分析

2.1 凍干菌粉活菌數

測得6株凍干菌粉的活菌數均在106CFU/g以上，符合GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》[23]對酸奶制作的要求。

2.2 酸度

各組酸奶凝乳時間及強度結果見表2。由表2可知，添加干酪乳桿菌（GL2）和開菲爾乳桿菌（700）菌株的酸奶凝乳時間最短，為10 h，基礎菌株發酵的酸奶凝乳時間最長，為13 h，說明添加這4種菌株均能提高其凝乳速度。五組的酸奶酸度符合GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》的要求，均在70°T以上。相較于組1，在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌雙菌發酵的基礎上添加酵母菌（Y18）、干酪乳桿菌（GL2）、副干酪乳桿菌（GL6）、開菲爾乳桿菌（700）均會提高酸奶的酸度，其中分別添加GL2和700的酸奶的酸度明顯增加，這兩種菌與酸奶體系中的基礎菌種具有相互促進作用，使得這兩種菌相較于GL6和Y18生長的更好。添加酵母菌Y18的酸奶的酸度沒有明顯增加。

表2 各組酸奶凝乳時間及酸度Table 2 Curd time and acidity of each group of yoghurt

研究表明[24-25]，酸奶的最佳酸度范圍是80～120°T，乙醛、丁二酮等風味物質要經過充分的后酸化過程才能達到發揮最佳效果的劑量，同時酸奶的組織狀態也會因此變得更加粘稠和堅實。本試驗中各組發酵乳凝乳時及后酸化的酸度均在80～120°T，說明這五種菌株添加不會引起不愉悅的口感。

2.3 質構

對發生后酸化1 d的酸奶進行質構分析，結果如表3所示。在基礎酸奶發酵劑的基礎上添加干酪乳桿菌（GL2）、副干酪乳桿菌（GL6）、開菲爾乳桿菌（700）會顯著提高酸奶的第一循環硬度、彈性和膠著性（P＜0.05），其中組2樣品第一循環硬度、彈性和膠著性最大，其次是組4，最后是組3。組5與組1的質構特征最為接近。五組酸奶的粘力都保持在20～25 g之間，差距并不明顯，說明這幾株菌的添加對酸奶的粘力影響是不大的。同時，酸化1d后酸奶的酸度與第一循環硬度、彈性、膠著性呈相同變化趨勢，說明酸奶的酸度改變對酸奶的組織結構狀態和黏稠度等會產生影響。

表3 酸奶質構分析結果Table 3 Results of texture analysis of yoghurt

2.4 有機酸含量

采用高效液相色譜儀對酸奶中的乳酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸這4種代表性有機酸進行定性和定量的測定，目的是對比五組酸奶中存在的有機酸成分差異。將五組酸奶樣品進行HPLC分析，再將測得的五組酸奶中這4種有機酸的峰面積代入4種有機酸的標準曲線回歸方程中計算出各自的含量，結果如表4所示。

表4 五組酸奶中四種有機酸的含量Table 4 Contents of four organic acids in five groups of yogurt

乳酸是通過乳酸菌代謝生成的非揮發性風味物質，是發酵乳特有風味的主要來源。由表4可知，除了Y18，其他3種菌株的添加均增加了酸奶的乳酸含量。檸檬酸是通過丙酮酸生物合成而來，可以代謝生成某些醇類物質，是發酵乳中特征風味物質的前提物質。酵母菌Y18的添加明顯降低了發酵乳中檸檬酸含量，其他四組樣品檸檬酸含量差異不大。乙酸可以反應成酯或氨基化合物，用作酸度調節劑、增味劑、香料等，為發酵乳提供揮發性風味。乙酸在五組酸奶中的含量都很低，均＜2 mg/g。組5中，雖然乳酸和檸檬酸的含量都遠遠低于其他組，但是其乙酸含量最高，達到1.44 mg/g，這可能與酵母菌在缺氧條件下額外生成的乙醇發生氧化有關。干酪乳桿菌GL2和開菲爾乳桿菌700的添加降低了酸奶的蘋果酸含量，副干酪乳桿菌GL6添加升高了酸奶的蘋果酸含量。

2.5 感官評價

2.5.1 感官評分

由感官評價小組對5組酸奶樣品和1組市售酸奶進行感官分析，最終的感官評分如表5所示。6組樣品感官評價總分為79.00分～92.55分，其中組2感官評價總分最高為92.55分，其次是組5和組4，感官評價總分分別為89.67分和89.56分，組1的感官評價總分為86.52分，組3和市售酸奶的感官評價總分最為接近，分別為79.17分和79.00分。

表5 六組酸奶的感官評分Table 5 Sensory scores of 6 groups of yogurt

續表

2.5.2 主成分分析

通過XLSTAT2016軟件對表5結果進行分析。酸奶樣品和感官指標在F1/F2坐標中的分布情況如圖1所示。LS700作為唯一一組在第二象限的酸奶樣品，與其余5組酸奶樣品感官特性差距較大。LSGL2位于第四象限X軸最右面，在果香、蒸煮味、紙板味方面表現突出，雖然LSGL2與LSY18在紙板味、谷物味方面表現相似，但是LSY18具有更突出的甜味和黃油味。盡管LS、TY和LSGL6均在第三象限，但是在Y軸上的LSGL6與市售酸奶TY的感官屬性更為接近，尤其是在干燥感、奶味、澀味這三方面，LS則在口感質地方面略微蝕牙。

圖1 酸奶樣品與感官指標在F1/F2坐標中的分布圖Fig.1 Distribution diagrams of yoghurt samples and sensory evaluation indexes in F1/F2

2.5.3 聚類分析

對酸奶樣品的感官特征強度進行聚類分析，得到的樹形圖如圖2所示。由圖2可知，6組酸奶樣品可分為三類：第一類是LS700，具有突出的發酵味，且細膩度和黏附性表現突出，這與該組酸奶的TPA檢測結果相符；第二類有LSGL2和LSY18，它們在果味、谷物味、紙板味、果香特征表現較顯著，在分散性方面較相似；由于LS、LSGL6、TY這三組酸奶樣品在蝕牙、干燥感、澀味、奶味方面表現較為突出且相似，故這三組被歸為成第三類。

圖2 酸奶的凝聚層次聚類樹形圖Fig.2 A gglomerative hierarchical clustering dendrogram of yoghurt

3 結論

復合發酵劑可直接影響酸奶的品質特性。向基于保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為主要乳酸菌的牛乳中分別添加干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、酵母菌、開菲爾乳桿菌進行混合發酵，添加第3種菌種會增加酸奶體系的酸度，其中添加干酪乳桿菌（GL2）和開菲爾乳桿菌（700）的酸奶酸度變化較大，說明GL2和700在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的酸奶系統中長勢較佳。酸度的大小影響著酸奶的稠實和彈性，以添加干酪乳桿菌（GL2）的酸奶在彈性（9.82mm）、膠著性（86 g）方面最為突出。5組樣品4種有機酸含量由高到低依次是：檸檬酸、乳酸、蘋果酸、乙酸，添加GL2、700和GL6提高了酸奶中乳酸的含量。添加干酪乳桿菌（GL2）的酸奶感官評分最高，在果香、蒸煮味、紙板味方面表現突出，但添加副干酪乳桿菌（GL6）的酸奶的感官特征與市售酸奶最為接近。