有機氮源對L-色氨酸發酵的影響

杜麗紅，張 震，徐慶陽*，陳 寧，尚永崇

（1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457）

L-色氨酸屬于芳香族氨基酸，是8種必需氨基酸之一[1]。因色氨酸對人和動物的生長發育、新陳代謝起著重要作用，已被廣泛用于醫藥、食品與飼料等行業[2-5]。

隨著生物技術的發展，利用微生物發酵法生產色氨酸得到全面推廣[6-7]。微生物發酵法具有原料價格低廉、工藝控制簡單、產品質量可靠等優點[8]。直接發酵法生產色氨酸離不開高產色氨酸的微生物菌株，但色氨酸合成途徑復雜且受多種調控機制的調節[9-10]，生產水平較低，很難在短時間內有較大突破，而發酵條件優化也逐漸受到人們關注，找到菌株的最適培養條件可發揮菌株的最大潛能。但隨著發酵工業的快速發展，發酵法生產L-色氨酸對培養基營養成分和發酵調控的合理性提出了更高的要求[11]。優良的L-色氨酸生產菌株、合理的培養基組成和適當的發酵調控策略有利于提高L-色氨酸的產酸水平[12]。在培養基成分中，以富含各種氨基酸及其他營養物質的酵母粉作為氮源，被廣泛應用于色氨酸的生產，黃靜等[13]通過對多種有機氮源進行實驗探究，確定了酵母粉為最適大腸桿菌發酵生產色氨酸的最佳氮源，但是酵母粉也含有一些蛋白質、色素等雜質，容易造成產酸波動[14-15]，從種類繁多的酵母粉中選擇出最適菌株的工作也很重要；氨基酸粉更多的是作為飼料添加劑使用，作為氮源應用于微生物發酵的研究還在起步階段[16-17]，應用于色氨酸發酵的研究還鮮見報道；氯化膽堿則可為細胞提供不穩定甲基，促進細胞生長代謝[18-19]應用于異亮氨酸發酵時[20]，不僅可提高產量，亦可提高糖酸轉化率。

本實驗選擇不同的有機氮源進行組合，并對其添加時間或添加量進行了研究，以期解決色氨酸發酵過程中遇到的各種問題。為提高大腸桿菌（Escherichia coli）TRP03積累色氨酸的能力，對酵母粉的種類進行了最優選擇；為避免菌株因氮源切換（速效氮源被利用完畢，細胞開始分解有機氮源進行利用）而出現的細胞生長停滯期，嘗試在培養基中添加氨基酸粉和氯化膽堿；為解決菌體早衰，提高中后期菌體活力，選擇添加酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺，并對添加時間進行了摸索，希望提高后期細胞產酸能力，進一步提高色氨酸產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）TRP03：天津科技大學代謝工程研究室。

斜面培養基：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 2.5 g/L，瓊脂25 g/L，pH 7.0～7.2。

種子培養基：葡萄糖30 g/L，酵母粉6 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KH2PO4g/L，檸檬酸0.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，FeSO4·7H2O 2.8mg/L，維生素B1（vitamin B1，VB1）0.2mg/L，生物素 1 mg/L，MnSO4·H2O 1.2 mg/L，pH 7.0～7.2。

發酵培養基：葡萄糖10 g/L，酵母粉3 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KH2PO44 g/L，檸檬酸2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，VB11.5 mg/L，FeSO4·7H2O 30 mg/L，生物素1 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，pH 7.0～7.2。

上述培養基均在115℃滅菌15 min。

1.1.3 化學試劑

葡萄糖：西王藥業有限公司鄒平分公司；（NH4）2SO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaOH：天津市光復科技發展有限公司；檸檬酸、MnSO4·H2O：國藥集團化學試劑有限公司；氨基酸粉、蛋氨酸：上海阿拉丁生物科技有限公司；氯化膽堿：上海瑞永生物科技有限公司；酵母粉[Springer 0805（總氮11.3%總氨基酸58.0%）、Springer 0820（總氮11.8%總氨基酸61.4%）、Springer 2006（總氮10.3%總氨基酸41.36%）、Springer0203（總氮10.6%總氨基酸52.3%）、Springer 1203（總氮11.0% 總氨基酸54.3%）、NucelR889PA（總氮11.5%總氨基酸60.1%）、Springer 0835（總氮11.5%總氨基酸59.5%）、Springer LP0021（總氮10.0%～12.5%總氨基酸52%～62%）]：法國BioSpringer有限公司；LP0021酵母提取物：英國OXOID公司；氨基酸粉：山東恩沐生物有限公司；實驗室所用化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

LRH-250-A生化培養箱：廣東省醫療器械廠；5 L離位滅菌發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；V-1200型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；SBA-40E生物傳感儀：山東省科學院研究所；UltiMate 3000高效液相色譜儀：美國Thermo Scientific公司；TCDA 161485活細胞在線檢測儀：英國ABER公司；MQD-A3R高精度三層疊加式振蕩培養箱：上海旻泉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

位于北京市海淀區上莊鎮白水洼路附近的有機蔬果園，自2002年創辦至今，占地面積已達300畝。園內擁有11個日光溫室，最多時每天可產出蔬果幾十種，取名良之悅品。

菌株活化：于甘油管中取一環菌液涂布于一代斜面培養基中，置于37℃培養箱中靜置培養12 h，于一代斜面培養基中取一環菌體活化于二代斜面培養基中，置于37℃培養箱中靜置培養12 h。

菌懸液制備：將200 mL去離子水裝于500 mL圓底燒瓶，121℃滅菌20 min，在無菌間將滅菌的去離子水倒入已活化好菌體的斜面培養基中，接種環將全部菌體輕輕刮起，再倒入圓底燒瓶中。

搖瓶培養方法：取一環菌體置于斜面培養基中37℃培養12 h，將活化好的菌株轉接于種子培養基中，裝液量為30 mL/250 mL，200 r/min、37℃搖床振蕩培養12 h，然后按10%接種量轉接于發酵培養基中，繼續37℃、200 r/min培養發酵24 h，測定發酵液中目的產物L-色氨酸含量。發酵過程中，苯酚紅為pH指示劑，控制pH值為7.0～7.2左右。

5 L離位滅菌發酵罐培養方法：種子培養基與搖瓶振蕩培養基成分相同，取適量無菌水于斜面培養基中，用接種環將菌體輕輕刮起制成菌懸液，接入種子培養基中，控制pH值為7.0左右，發酵溫度37℃，溶氧25%～35%，待細胞OD600nm值達到10～12。按15%～20%接種量接入新鮮的發酵培養基，發酵過程中通過流加氨水（NH4OH）來控制pH 7.0左右，發酵溫度37℃，溶氧25%～35%之間；當培養基中的葡萄糖消耗完之后，流加800 g/L葡萄糖溶液，保證發酵培養基中的葡萄糖質量濃度在0.1～5.0 g/L；發酵周期36 h。

1.3.2 測定方法

生物量的測定：通過生物傳感儀測量波長600 nm處的吸光度值（OD600nm）來監測細胞的生長；葡萄糖含量測定：通過生物傳感儀實時測定發酵液中的葡萄糖濃度；活細胞檢測：使用活細胞在線檢測儀。

L-色氨酸測定：采用高效液相色譜法，其色譜條件為：采用Gemini C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為體積比2∶98的乙腈-水混合液，流速控制在1 mL/min，檢測波長278 nm，溫度為40℃。

2 結果與分析

2.1 不同酵母粉對L-色氨酸生產的影響

為提高菌株TRP03生產色氨酸的能力，選擇了8種不同的酵母粉，分別是Springer 0805、Springer 0820、Springer 2006、Springer 0203、Springer 1203、Nucel R 889PA、Springer 0835和LP0021酵母提取物進行了搖瓶發酵實驗，每組設定3個平行實驗，實驗室常用的酵母粉為LP0021酵母提取物，將此組作為對照組。搖瓶發酵24 h后，對菌體OD600nm值和L-色氨酸積累進行了測定，結果如圖1所示。

圖1 不同氮源對菌體生長（A）和L-色氨酸產量（B）的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on cell growth(A)andL-tryptophan production(B)

由圖1可知，8組實驗中，第2組耗氨、耗糖速率最快，綜合兩項指標來看，其余6組均與對照組無太大差異，說明相應氮源效果與對照組相當。發酵結束時，第2組OD600nm值為29.8，比對照組高8.31%，色氨酸平均產量為10.25 g/L，比對照組高25.77%，并且兩個指標均為第8組中最高，同時氮源Springer 0820中，總含氮量為11.8%，與其他酵母粉相差不大，但是總氨基酸含量61.4%，明顯高于其他酵母粉含量，因此，Springer 0820酵母粉更容易被菌體吸收利用，有利于菌體生長和產酸，適合被用作E.coli TRP03的發酵培養基氮源。

2.2 氨基酸粉和氯化膽堿的添加對L-色氨酸生產的影響

上述搖瓶實驗中，確定了最佳酵母粉為Springer 0820后，進行了5 L發酵罐發酵性能實驗，結果發現，在菌體發酵前期，溶氧緩慢回升，應該是速效氮源被細胞利用完畢，遲效氮源沒有及時被細胞分解利用，細胞生長受到影響，同時在該階段中細胞生產色氨酸的能力也隨之下降。為解決該問題，選擇在培養基中添加富含各種氨基酸能快速被細胞利用的氨基酸粉和可作甲基供體的氯化膽堿，分別在發酵培養基中添加1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L的氨基酸粉，同時以不添加氨基酸粉的發酵菌株為對照組，發酵過程中菌體生長情況和L-色氨酸產量結果見圖2；分別在發酵培養基中添加0.2 g/L、0.5 g/L、0.8 g/L的氯化膽堿，同時以未添加氯化膽堿組為對照組，發酵過程中菌體生長情況和L-色氨酸產量結果見圖3；同時添加氨基酸粉和氯化膽堿，配比分別為氨基酸粉1.5g/L和氯化膽堿0.5 g/L，氨基酸粉2.0 g/L和氯化膽堿0.5 g/L，氨基酸粉2.0 g/L和氯化膽堿0.2 g/L，同時以不添加氨基酸粉和氯化膽堿組為對照組，菌體生長情況和L-色氨酸積累見圖4。

圖2 不同氨基酸粉添加量對菌體生長（A）和L-色氨酸產量（B）的影響Fig.2 Effects of different addition of amino acid powder on cell growth(A)and L-tryptophan production(B)

由圖2A和2B可知，在1.5～3.0h時，對照組在該階段的細胞生長幾乎處于停滯狀態，L-色氨酸積累速率為0.289g/（L·h）；當氨基酸粉添加量在1.5 g/L時，細胞生長仍較緩慢，趨勢與不添加氨基酸粉基本相同，說明該階段的細胞二次生長現象沒有得到緩解；當氨基酸粉添加量為2 g/L時，細胞生長速率得到明顯緩解，2.5 h后，細胞進入正常生長狀態，同時，L-色氨酸生產速率為0.428 8 g/（L·h），較對照組提高近50%，但是在1.5～2.5 h，細胞生長仍較緩慢，表明氨基酸粉添加為2 g/L時，不能完全避免因氮源替換帶來的二次生長現象；當氨基酸粉添加量為2.5 g/L時，產L-色氨酸速率為0.397 8 g/（L·h），說明氨基酸粉添加量＞2 g/L后，沒有繼續提升L-色氨酸產量。結果表明，氨基酸粉最佳添加量為2 g/L，很大程度上解決了細胞生長遲緩的情況。同時，縱觀整個發酵過程，氨基酸粉的添加一定程度上加速了細胞的生長，當添加量＜2 g/L時，雖然細胞生長加快，但同時菌體衰亡也較對照組提前了1～2 h，當添加量提高至≥2 g/L時，細胞衰亡提前了3～4 h，但是L-色氨酸最終產量為39.12 g/L，較對照組提高了8.28%。

圖3 不同氯化膽堿添加量對菌體生長（A）和L-色氨酸產量（B）的影響Fig.3 Effects of different addition of choline chloride on cell growth(A)and L-tryptophan production(B)

由圖3A和3B可知，在發酵1.5～3.0 h內，氯化膽堿添加量為0.2 g/L時，細胞生長仍較緩慢；當氯化膽堿添加量提升至0.5 g/L時，細胞生長情況得到明顯改善，2 h后細胞進入快速生長階段，隨著細胞快速生長，L-色氨酸積累速率也得到快遞提升，但是1.5～2 h，細胞仍處于生長停滯狀態；當氯化膽堿添加量繼續提升至0.8 g/L時，細胞生長狀態沒有進一步得到改善，二次生長現象沒有完全消除。在整個發酵過程中，3個實驗組細胞生長速度較對照組均不同程度加快，但是也使得細胞衰亡有不同程度提前，此外，L-色氨酸積累得到提升，但是添加量＞0.5 g/L之后，L-色氨酸生產會明顯低于添加量為0.5 g/L的實驗組。

由圖4A和4B可知，在發酵時間1.5～3.0 h，添加配比為氨基酸粉1.5 g/L、氯化膽堿0.5 g/L和氨基酸粉2.0 g/L、氯化膽堿0.2 g/L時，很大程度上提高了細胞生長速率，細胞停滯生長時間縮小為0.5 h，L-色氨酸積累也得到提高；當添加配比為氨基酸粉2.0 g/L和氯化膽堿0.5 g/L時，細胞處于持續生長狀態，細胞停滯生長階段得到完全解除，同時色氨酸持續積累，積累速率較對照組提高了4倍左右，因此，確定氨基酸粉2.0 g/L和氯化膽堿0.5 g/L為最佳添加配比。在整個發酵過程中，3個實驗組在4 h進入了快速生長階段，較對照組提前了2h，最佳配比下，最高菌體量（OD600nm值）可達92，較對照組提高了13.88%，L-色氨酸最終積累44.21g/L，較對照組提高22.22%，較其他兩個實驗組提高12.82%，但是，在20 h后，細胞不再繼續生長，產酸速率緩慢降低。

圖4 不同組合的氨基酸粉和氯化膽堿的添加對菌體生長（A）和L-色氨酸產量（B）的影響Fig.4 Effects of different combinations of amino acid powder and choline chloride on cell growth(A)and L-tryptophan production(B)

氨基酸粉和氯化膽堿二者的單獨添加均可在一定水平上解決細胞二次生長的問題，而同時添加則可以完全避免二次生長，結果符合預期。

2.3 酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺的流加對L-色氨酸發酵的影響

為緩解細胞衰亡，菌體活力降低和產酸速率下降等現象，選擇在發酵不同時期流加酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺（質量濃度均為1 g/L）混合液，蛋氨酸為胞內重要的甲基供體，谷氨酰胺則為色氨酸合成的前體物之一，通過流加混合液，及時滿足胞內各種反應所需的氨基酸、甲基及色氨酸合成所需的前體，希望在解決菌體活力下降問題的同時，進一步提高L-色氨酸產量?；旌弦旱牧骷訒r間選擇發酵6h、10h、14h，流加方式選擇隨糖流加，流加速率為0.01g/L，流加至20 h停止流加。并以不流加酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺菌株（解除二次生長現象的菌株）為對照組，對細胞生長、色氨酸產量、活細胞數進行了分析，結果見圖5。

圖5 不同時期的酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺添加對菌體生長（A）、L-色氨酸產量（B）和活細胞數（C）的影響Fig.5 Effects of yeast powder,methionine and glutamine addition at different stages on cell growth(A),L-tryptophan production(B)and viable cell count(C)

由圖5可知，在6 h補加混合營養物時，發酵前期，菌體生長和L-色氨酸積累有微量提高，菌體衰亡延遲了2 h，L-色氨酸產量在46 g/L左右，22 h后，活細胞數雖然在下降，但是較對照組有了明顯改善；在14 h添加混合營養物時，菌體衰亡得到進一步改善，因活細胞數的增加，L-色氨酸產量得到進一步提高，達48 g/L，較對照組提高了9.09%；添加時間為10h時，在發酵20h后，雖然菌體量沒有進一步生長，但是趨于平穩狀態，活細胞數也得到穩定，最終活細胞數較對照組提高了30.18%，較其他兩組提高了近8.85%，在菌體活力得到改善的條件下，L-色氨酸最終可積累51.23 g/L，較對照菌株提高了16.43%，較14 h添加混合營養物時的L-色氨酸積累量提高了6.73%。

3 結論

本研究通過優化有機氮源、不同時期添加不同營養物質逐步改善了細胞生長狀態，L-色氨酸積累得到提升。選擇Springer 0820為氮源時，菌株生長和L-色氨酸產量均得到提升，利用5 L生物反應器進行發酵，在培養基中同時添加氨基酸粉2.0 g/L，氯化膽堿0.5g/L時，可完全解除細胞因氮源切換造成的停滯期，同時最終L-色氨酸可積累44.21g/L，較對照組提高20.85%，在發酵10 h流加酵母粉、蛋氨酸和谷氨酰胺，明顯改善了細胞的衰亡問題，24 h后，電容值持續穩定在14 pF，意味著活細胞數沒有出現明顯下降趨勢，同時L-色氨酸生產速率維持在1.15 g/（L·h），最終L-色氨酸產量在51.23 g/L，較未經任何優化的菌株提高41.91%。