不同來源酒曲釀制米酒中乳酸菌的分離與鑒定

向凡舒，鄧 風，魏冰倩，鐘小丹，張振東，郭 壯，趙慧君*

（1.湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.湖北米婆婆生物科技股份有限公司，湖北 孝感 432003）

米酒，又稱甜酒、酒釀、醪糟等，是一種澄清并具有甜味、略帶酸味的發酵類含酒精飲料，通常以糯米類作物為原料，以米酒曲為發酵劑室溫發酵2～3 d制得。米酒作為一種混合菌發酵產品，其質量和風味的好壞取決于米酒曲中微生物的群落組成及各菌種之間的代謝關系、代謝產物與產品的比例關系等。米酒曲是在特定的生態環境中，用成曲作為母種培養制作而成，含有包括細菌和真菌在內的大量微生物，對米酒品質的形成起著決定性作用，因而有“曲是酒之骨”之稱[1-3]。相對于工業化生產的米酒曲，民間傳統釀造米酒曲中微生物多樣性更高，釀造的米酒風味也更為獨特，同時也加劇了不同地區間米酒風味的差異。

目前，關于孝感米酒中微生物的研究多集中在霉菌和酵母菌，王小紅等[4-5]采用傳統純培養法對孝感米酒或米酒曲中根霉和酵母菌進行了分離。目前，研究和應用的乳酸菌多從傳統發酵乳制品、泡菜或者人體腸道中分離得到，而以米酒曲為分離源的乳酸菌報道尚少。乳酸菌在米酒發酵過程中起到了關鍵的作用，其產生的乳酸、乙醛和雙乙酰等風味物質對米酒的感官品質具有顯著地影響。米酒中乳酸菌多樣性的研究已有很多，主要是基于宏基因組學方法和傳統純培養方法。JIAO J K等[6-9]利用（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術分別對中國6個不同地區米酒、韓國燒酒發酵過程、韓國米酒以及中國7個不同地區米酒曲中乳酸菌的多樣性進行了研究。除韓國燒酒在發酵過程中乳酸菌不是優勢菌株外，其余均檢測到多種乳酸菌；沈馨等[10]采用MiSeq高通量測序分析孝感鳳窩酒曲細菌多樣性發現，12個核心優勢操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）中，2個隸屬于乳酸菌；苗乘源等[11-14]采用純培養方法對傳統釀造米酒中的優勢微生物及乳酸菌進行研究發現，不同來源米酒中的乳酸菌種類也不相同，具有地方差異性；沈馨等[15-16]從米酒中分離乳酸菌并研究其對米酒和黃酒品質的影響，探索米酒中乳酸菌在工業應用中的潛力。

本研究分別以湖北孝感和四川成都來源的米酒曲為發酵劑發酵制作米酒，并采用改良MRS培養基、分子生物學技術對米酒中的乳酸菌進行了分離、鑒定，深入研究傳統制作米酒中乳酸菌的多樣性，對其微生物多樣性信息進行全面系統的解析具有極為重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 米酒曲

酒曲：從湖北孝感地區和四川成都地區各采集10種，分別編號為XG1-XG10和CD1-CD10，其中孝感地區采集的米酒曲均為鳳窩酒曲，成都導區采集的米酒曲為農家自制。

1.1.2 試劑

苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、Tris、乙二胺四乙酸二鈉、十二烷基硫酸鈉、冰乙酸、碳酸鈣、氯化鈉、瓊脂粉等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；r Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）聚合酶（5U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、pMD18-T、DNAMarker：大連寶日醫生物技術有限公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖（均為生化試劑）、溶菌酶（酶活≥20000U/mg）、蛋白酶K（40 U/mg）、2×PCR mix、大腸桿菌（Escherichia coli）Top 10感受態細胞、氨芐青霉素：索來寶生物技術有限公司；AXGEN PCR清潔試劑盒：北京科博匯智生物科技發展有限公司；引物：武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

MRS固（液）體培養基：北京陸橋技術股份有限公司。

改良MRS固體培養基[17]：在MRS固體培養基中添加1.5%的CaCO3。

LB液體培養基[18]：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L。添加瓊脂粉15 g/L為LB固體培養基。

上述培養基均在121℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DG250厭氧工作站：英國Don Whitley Scientific公司；CT15RE冷凍離心機：日本HITACHI公司；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；PTC-100PCR儀：美國ABI公司；DYY-BC型電泳儀：北京六一儀器廠；Fluor Chem FC3：美國ProteinSimple公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米酒的制作工藝流程及操作要點

4.檢驗方法。同一檢驗項目中一般存在著不同種類的檢驗方法，方法選取不當也會造成食品檢驗結果出現偏差，從而影響檢驗結果的準確性。

按照參考文獻[19]制作米酒。操作要點：糯米浸泡、蒸煮和攤涼后，按照每千克糯米添加3 g米酒曲的比例進行落罐搭窩，并在28℃發酵48 h備用。

1.3.2 乳酸菌的分離與純化

無菌條件下，取1mL米酒，加入9mL生理鹽水中，然后以10倍稀釋法進行梯度稀釋后，吸取0.2mL稀釋度為10-5和10-6的稀釋液涂布于MRS固體培養基，每個梯度重復3次，置于30℃厭氧工作站中倒置培養48h。待乳酸菌長出后，在改良MRS固體培養基上劃線分離純化2～3次，挑取產生透明圈的單菌落于MRS液體培養基中，30℃振蕩培養24h。革蘭氏染色后進行鏡檢，同時進行過氧化氫酶試驗。將純種、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株保存于-80℃超低溫冰箱中保藏。

1.3.3 乳酸菌的分子生物學鑒定

參照文獻[20]提取乳酸菌的基因組DNA，以其為模板，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1495R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）PCR擴增乳酸菌的16SrDNA基因。PCR擴增體系：10×r Taq buffer（Mg2+plus）2.5 μL，27F（10 mmol/L）0.5 μL，1495R（10 mmol/L）0.5 μL，dNTP mix（2.5 mmol/L）2 μL，r Taq DNA polymerase（5U/μL）0.5μL，DNA模板2μL，無菌水補足25μL。PCR擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2 min，30個循環；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR擴增產物經AXGEN PCR清潔試劑盒清潔后，與pMD18-T載體連接，并轉化至E.coli TOP10感受態細胞中，挑取單克隆子進行菌液PCR擴增，驗證陽性克隆。引物為M13F（-47）（5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′）和M13R（-48）（5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′）。PCR擴增體系：2×PCR mix 12.5 μL，M13F（-47）（10 mmol/L）0.5 μL，M13R（-48）（10 mmol/L）0.5 μL，菌液2 μL，無菌水補足25 μL。PCR擴增條件同16S rDNA擴增條件。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，陽性克隆送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。測序結果在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進行BLAST同源性比對，選取同源性較高的模式菌株，采用MEGA 4.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹[21-22]，自展數據集為1 000次。

2 結果與分析

2.1 孝感和成都米酒曲制作的米酒中乳酸菌的分離結果

采用傳統培養進行乳酸菌的分離，選取改良MRS固體培養基上有透明圈、過氧化氫酶陰性和革蘭氏陽性的菌株進行統計。從10個孝感米酒曲制作的米酒中共分離到42株疑似乳酸菌，菌株編號為XG1-1～XG1-4、XG2-1～XG2-3、XG3-1～XG3-3、XG4-1～XG4-5、XG5-1～XG5-4、XG6-1～XG6-3、XG7-1～XG7-4、XG8-1～XG8-3、XG9-1～XG9-6、XG10-1～XG10-7。從10個成都米酒曲制作的米酒中共分離到的35株疑似乳酸菌，菌株編號為CD1-1～CD1-5、CD2-1～CD2-4、CD3-1～CD3-4、CD4-1～CD4-5、CD5-1～CD5-4、CD6-1～CD6-3、CD7-1～CD7-3、CD8-1～CD8-3、CD9-1～CD9-3、CD10-1。

2.2 孝感米酒曲制作的米酒中乳酸菌的分子生物學鑒定結果

42株乳酸菌的16S rDNA測序結果在NCBI上進行BLAST同源性比對，并申請了登錄號，結果見表1。

表1 孝感米酒中乳酸菌16S rDNA基因序列的比對結果及登錄號Table 1 Alignment results of 16S rDNA sequences and accession number of lactic acid bacteria from Xiaogan rice wine

基于16S rDNA基因序列，采用MEGA 4.0軟件中的NJ法構建系統發育樹，結果見圖1。

圖1 基于16S rDNA基因序列構建孝感米酒中乳酸菌系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria from Xiaogan rice wine based on 16S rDNA gene sequences

由圖1可知，菌株XG1-1、XG1-4、XG2-2、XG3-2、XG4-3、XG4-4、XG5-1、XG5-2、XG5-3、XG5-4、XG6-1、XG6-3、XG7-1、XG7-2、XG7-3、XG7-4、XG8-1、XG8-2、XG9-1、XG10-5與P.pentosaceus聚于一支，相似度較高；菌株XG1-2、XG2-1、XG4-2、XG4-5、XG9-3、XG9-5、XG9-6、XG10-1、XG10-3、XG10-4與W.confusa聚于一支，相似度較高；菌株XG1-3、XG2-3、XG3-1、XG6-2、XG9-2、XG10-6與L.plantarum聚于一支，相似度較高；菌株XG8-3、XG9-4、XG10-2與E.faecium聚于一支，相似度較高；菌株XG3-3與L.fermentum聚于一支，相似度較高；菌株XG4-1與L.agilis聚于一支，相似度較高；菌株XG10-7與L.lactis聚于一支，相似度較高；因此，42株乳酸菌分別被鑒定為P.pentosaceus（20株）、W.confusa（10株）、L.plantarum（6株）、E.faecium（3株）、L.fermentum（1株）、L.agilis（1株）、L.lactis（1株）。

2.3 成都米酒曲制作的米酒中乳酸菌的分子生物學鑒定結果

35株乳酸菌的16S rDNA測序結果在NCBI上進行BLAST同源性比對，并申請了登錄號，結果見表2。

基于16S rDNA基因序列，采用MEGA 4.0軟件中的NJ法構建系統發育樹，結果見圖2。

表2 成都米酒中乳酸菌16S rDNA基因序列的比對結果及登錄號Table 2 Alignment results of 16S rDNA sequences and accession number of lactic acid bacteria from Chengdu rice wine

續表

圖2 基于16S rDNA基因序列構建成都米酒中乳酸菌系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria from Chengdu rice wine based on 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株CD1-1～CD1-5、CD2-1、CD2-2、CD3-4、CD4-1～CD4-3、CD5-1、CD5-2、CD6-2、CD6-3、CD7-1、CD8-2、CD8-3、CD9-1、CD10-1與P.pentosaceus聚于一支，相似度較高；菌株CD3-1、CD3-3、CD4-5、CD7-2、CD9-2與L.plantarum聚于一支，相似度較高；菌株CD3-2、CD5-3、CD5-4、CD8-1與W.cibaria聚于一支，相似度較高；菌株CD2-3、CD6-1與W.confusa聚于一支，相似度較高；菌株CD4-4、CD9-3與L.brevis聚于一支，相似度較高；菌株CD2-4與E.faecium聚于一支，相似度較高；菌株CD7-3與L.johnsonii聚于一支，相似度較高；因此，42株乳酸菌分別被鑒定為P.pentosaceus（20株）、L.plantarum（5株）、W.cibaria（4株）、W.confusa（2株）、L.brevis（2株）、E.faecium（1株）、L.johnsonii（1株）。

2.4 孝感和成都米酒曲制作的米酒中乳酸菌的比較

孝感和成都米酒曲制作的米酒中乳酸菌的比較結果見表3。

表3 孝感和成都米酒曲制作的米酒中乳酸菌的比較Table 3 Comparison of lactic acid bacteria between Xiaogan rice wine and Chengdu rice wine

由表3可知，在兩種米酒中，分離的P.pentosaceus數量均最多，均為20株，分別占總分離乳酸菌數的47.6%、57.1%，說明P.pentosaceus為兩種米酒的優勢菌株。除P.pentosaceus外，兩種米酒中分離出的相同種屬的菌株還包括W.confusa、L.plantarum和E.faecium，其中，W.confusa在孝感米酒中分離出10株，在成都米酒中僅分離出2株；L.plantarum在孝感和成都米酒中分別分離出6株和5株，E.faecium在兩種米酒中分離出的數量均較少。L.fermentum、L.agilis和L.lactis為孝感米酒中特有的乳酸菌，但數量均較少，均只分離到1株。W.cibaria、L.johnsonii和L.brevis為成都米酒中特有的乳酸菌，其中W.cibaria有4株，而L.johnsonii和L.brevis數量較少，分別分離到1、2株。結果表明，孝感米酒曲和成都米酒曲中的優勢乳酸菌相同。

JIAO J K等[6]利用PCR-DGGE方法研究黑龍江、南京6個不同樣本中的乳酸菌發現，L.plantarum、L.namurensis和P.acidilactici為優勢菌株，與本研究分離的優勢乳酸菌株為P.pentosaceus具有差異。張振東等[9，15-16，22]均采用純培養方法從孝感米酒中分離乳酸菌，與本研究相比，雖然優勢乳酸菌均有所不同，但是菌株的種屬上是一致的，且本研究中分離得到的乳酸菌種類最全。

JIAO J K等[6]將分離到的乳酸菌用于米酒的發酵發現，參與發酵的乳酸菌的種類越多，米酒的感官特性就越好。王丹丹等[22]將分離自孝感米酒的乳酸菌用于米酒的制作發現，分離到的乳酸菌對米酒有機酸種類與含量、固形物含量與米酒的滋味產生了顯著影響（P＜0.05），且同一類乳酸菌對米酒滋味具有類似的影響。可見乳酸菌在米酒發酵過程中起到了關鍵的作用，其對米酒的感官品質具有顯著地影響。本研究中分離到的各類菌株對米酒滋味的影響是下一步研究的重點。

3 結論

采用孝感鳳窩米酒曲和成都農家自制米酒曲制作米酒，利用含有1.5%CaCO3的改良MRS培養基從兩種米酒中共分離得到77株乳酸菌，其中，從孝感米酒中分離出42株乳酸菌，經分子生物學鑒定，隸屬于7個種，分別為P.pentosaceus（20株）、W.confusa（10株）、L.plantarum（6株）、E.faecium（3株）、L.fermentum（1株）、L.agilis（1株）、L.lactis（1株）。從成都米酒中共分離出35株乳酸菌，經分子生物學鑒定，隸屬于7個種，分別為P.pentosaceu s（20株）、L.plantarum（5株）、W.cibaria（4株）、W.confusa（2株）、L.brevis（2株）、E.faecium（1株）、L.johnsonii（1株）。兩種米酒中分離的P.pentosaceus數量最多，分別占47.6%、57.1%，為優勢菌株。除P.pentosaceus外，兩種米酒中分離出的相同種還包括W.confusa、L.plantarum和E.faecium；L.fermentum、L.agilis和L.lactis為孝感米酒中特有的乳酸菌，W.cibaria、L.johnsonii和L.brevis為成都米酒中特有的乳酸菌。