響應(yīng)面法優(yōu)化木醋桿菌NUST4.2種子擴(kuò)大培養(yǎng)條件

孫汴京，林建斌，自 強(qiáng)，陳春濤，孫東平*

（南京理工大學(xué) 化工學(xué)院，江蘇 南京 210094）

細(xì)菌纖維素是由某些微生物合成的一種多糖類高分子[1]，其三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與植物纖維素的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基本相同，都屬于天然纖維素。但細(xì)菌纖維素的純度比植物纖維素的純度大，且合成效率也比植物纖維素的合成效率高，故細(xì)菌纖維素有植物纖維素?zé)o法比擬的特性[2-3]。在國內(nèi)，對(duì)細(xì)菌纖維素的研究時(shí)間較短，研究人員已經(jīng)認(rèn)識(shí)到其蘊(yùn)藏的發(fā)展前景和巨大的商機(jī)[4-5]。

工業(yè)化生產(chǎn)纖維素的菌株必須滿足纖維素產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、菌體生長速度快、菌體傳代培養(yǎng)后遺傳性狀穩(wěn)定等條件[6]。目前，能夠應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的菌株只有醋酸菌屬（Acetobacter）中的某些菌株[7]。醋酸菌屬中的木醋桿菌（Acetobacter xylinum）是細(xì)菌纖維素工業(yè)化生產(chǎn)中使用的典型菌種，也是細(xì)菌纖維素合成機(jī)理、形貌特征及結(jié)構(gòu)研究的典型菌株[8-9]。當(dāng)培養(yǎng)菌株的環(huán)境條件變化時(shí)，需要對(duì)優(yōu)良菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，使菌種在短時(shí)間內(nèi)的群體遺傳過程占優(yōu)勢(shì)并具有較高的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)能力[10-11]。根據(jù)菌種的生理特性，選擇合適的培養(yǎng)條件培養(yǎng)得到代謝旺盛的種子液，不僅可有效縮短發(fā)酵生產(chǎn)周期，而且可提高設(shè)備利用率[12]。

目前，基于Plackeet-Burman設(shè)計(jì)法的響應(yīng)面分析法被越來越多的應(yīng)用在細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化上[13-14]，但是應(yīng)用于細(xì)菌纖維素種子液擴(kuò)大培養(yǎng)條件優(yōu)化研究還鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以木醋桿菌NUST4.2為研究對(duì)象，OD600nm值為響應(yīng)值，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法、最陡爬坡路徑法和響應(yīng)面分析法相結(jié)合對(duì)木醋桿菌NUST4.2種子擴(kuò)大培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化[15-17]，為工業(yè)化生產(chǎn)細(xì)菌纖維素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

木醋桿菌（Acetobacter xylinum）NUST4.2：由本實(shí)驗(yàn)室從殘次水果中篩選出產(chǎn)纖維素的野生菌，對(duì)其進(jìn)行紫外誘變改良獲得，并4℃保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

纖維素酶（10 000 U/g）：阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、檸檬酸、硫酸鎂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蔗糖：上海西王糖淀粉有限公司；磷酸二氫鉀：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨：上海博維生物科技有限公司；酵母浸粉、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。以上試劑均為生化試劑或分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蔗糖10 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L，檸檬酸1.1 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉1.0 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH值6.0，用去離子水配制。121℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L，檸檬酸1.1 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉1.0 g/L，自然pH，用去離子水配制。121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；QHZ-98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠；FZ-D20L機(jī)械攪拌種子罐：江蘇豐澤生物工程設(shè)備制造有限公司；UV-1100可見-紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 木醋桿菌NUST4.2種子擴(kuò)大培養(yǎng)

挑取一環(huán)活化的斜面菌種至種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，然后以10%（V/V）的接種量將種子液轉(zhuǎn)移至20 L機(jī)械攪拌種子罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，30℃動(dòng)態(tài)培養(yǎng)36 h，取樣測(cè)定菌體密度（OD600nm值）。

1.3.2 木醋桿菌NUST4.2種子擴(kuò)大培養(yǎng)條件優(yōu)化

Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)：Plackett-Burman試驗(yàn)是一種近飽和兩水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能以最少的試驗(yàn)次數(shù)對(duì)多種因素中的主效應(yīng)進(jìn)行估計(jì)，可以快速有效地從眾多待考察的因素中篩選出關(guān)鍵的影響因素，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)[14]。因此，以菌體OD600nm值（Y）為響應(yīng)值，選取對(duì)木醋桿菌NUST4.2種子擴(kuò)大培養(yǎng)影響的裝液量（A）、初始pH值（B）、攪拌轉(zhuǎn)速（D）、消泡劑用量（E）、罐壓（G）和通氣量（H）6個(gè)因素，采用N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行篩選優(yōu)化，每個(gè)因素取2水平，分別設(shè)為-1和1，C和F為空白項(xiàng)。PB試驗(yàn)因素與水平見表1。

最陡爬坡法試驗(yàn)：采取最陡爬坡試驗(yàn)法尋找響應(yīng)值最大時(shí)的因素組合，以最大值組合作為中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

中心組合設(shè)計(jì)（central compositedesign，CCD）：CCD是國際上常用的一種響應(yīng)面法，能夠用有限的試驗(yàn)次數(shù)對(duì)影響生物生長代謝過程的主要因素及其交互作用進(jìn)行有效評(píng)價(jià)，并且能夠優(yōu)化各因子[18]。在PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對(duì)擬合數(shù)學(xué)模型和方差進(jìn)行分析，通過各因素及其交互作用對(duì)微生物生長的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，得到響應(yīng)值最大時(shí)的最優(yōu)條件。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

驗(yàn)證試驗(yàn)：利用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 測(cè)定方法

菌體密度的測(cè)定：比濁法測(cè)定[18-19]。取纖維素酶2 g置于100 mL 0.1 mol/L醋酸鉀-醋酸緩沖溶液中進(jìn)行活化。取菌液10 mL置于10 mL纖維素酶溶液中，在50℃、pH 5.0條件下充分水解2 h，稀釋20倍后，于波長600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體濃度與OD600nm值的線性關(guān)系

通過線性擬合得到菌體濃度（x）與OD600nm值（y）的線性關(guān)系方程式為y=1.098x+0.022 7，其相關(guān)性系數(shù)R2=0.996 8。因此，采用種子液的OD600nm值來表示其生長情況具有較高的可靠性。

2.2 木醋桿菌NUST4.2種子擴(kuò)大培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

續(xù)表

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

由表3可知，在6個(gè)對(duì)木醋桿菌NUST4.2 OD600nm值有影響的因素中有3個(gè)顯著性因素，分別為D、E和H，即攪拌轉(zhuǎn)速、消泡劑用量和通氣量，影響主次順序?yàn)镈＞H＞E，其中攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量對(duì)木醋桿菌NUST4.2 OD600nm值的影響呈現(xiàn)正效應(yīng)，而消泡劑用量對(duì)木醋桿菌NUST4.2 OD600nm值的影響呈現(xiàn)負(fù)效應(yīng)，即提高攪拌轉(zhuǎn)速、增大通氣量并減少消泡劑用量有利于提高木醋桿菌NUST4.2種子液的菌體濃度，確定3種顯著因素后進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析

在PB試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定顯著影響因素（攪拌轉(zhuǎn)速、消泡劑用量和通氣量）的爬坡方向和步長，最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiments

由表4可知，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為240r/min、通氣量為1.6Nm3/h、消泡劑用量為0.06%時(shí)，OD600nm值最大，以此組合為中心進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，以確定主要影響因素的最優(yōu)水平。

2.2.3 中心組合試驗(yàn)結(jié)果與分析

采用二次回歸的旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)，以攪拌轉(zhuǎn)速（X1）、通氣量（X2）、消泡劑用量（X3）為自變量，以O(shè)D600nm值（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素5水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，5個(gè)水平分別為-α、-1、0、1、α（其中α=2k/4，k=3，α=1.682），中心組合試驗(yàn)因素與水平見表5，結(jié)果與分析見表6，方差分析結(jié)果見表7。

表5 中心組合試驗(yàn)的因素與水平Table 5 Factors and levels of central composite experiments

表6 中心組合試驗(yàn)的結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of central composite experiments

利用Minitab軟件對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得出以O(shè)D600nm值為響應(yīng)指標(biāo)的二次回歸擬合方程：Y=0.629 2+0.028 89X1+0.039 91X2-0.012 25X3-0.012 26X12-0.017 56X22-0.03347X32+0.00250X1X2-0.02000X1X3+0.00750X2X3。由表7可知，回歸模型P值為0.01，失擬項(xiàng)P值＞0.01，表明模型可靠，無失擬因素存在。模型的決定系數(shù)R2=89.87%，與調(diào)整決定系數(shù)R2adj=80.76%接近，表明回歸模型的擬合效果較好。一次項(xiàng)X1、X2和二次項(xiàng)X32對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)X22對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of the regression model

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得出，木醋桿菌NUST4.2種子擴(kuò)大培養(yǎng)的最優(yōu)條件為攪拌轉(zhuǎn)速257 r/min，通氣量為1.72 Nm3/h，消泡劑用量0.054%。在此優(yōu)化條件下，OD600nm值最大，理論值為0.681。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在給定的最優(yōu)條件下，即攪拌轉(zhuǎn)速257 r/min，通氣量1.72 Nm3/h，消泡劑用量0.054%，木醋桿菌培養(yǎng)36 h后，OD600nm值為0.70，與回歸模型的預(yù)測(cè)值接近，說明模型的擬合比較理想，證實(shí)了模型的有效性。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)，快速有效地從6個(gè)影響種子擴(kuò)大培養(yǎng)的因素中篩選出3個(gè)顯著性影響因素：攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量和消泡劑用量。然后利用最陡爬坡法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域，并用中心組合設(shè)計(jì)得出最優(yōu)培養(yǎng)條件：裝液量70%、初始pH值6.0、攪拌轉(zhuǎn)速257 r/min、消泡劑用量0.054%、罐壓0.2 MPa、通氣量1.72 Nm3/h。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，種子擴(kuò)大培養(yǎng)的菌體密度OD600nm值為0.70，較優(yōu)化前提高10%。