一株海洋低溫葡萄糖氧化酶擔(dān)子菌的誘變育種及其酶學(xué)性質(zhì)研究

劉春瑩，王一茜，遲乃玉，張慶芳*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一種應(yīng)用廣泛的工業(yè)用酶，如畜牧、食品、醫(yī)療等行業(yè)[1-2]。GOD在分子氧的存在下，可專一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸內(nèi)酯[3]，葡萄糖酸內(nèi)酯在非酶促條件下自發(fā)與水結(jié)合生成葡萄糖酸與過(guò)氧化氫[4]。

目前產(chǎn)葡萄糖氧化酶的菌株主要為陸地來(lái)源的霉菌及其工程菌[5-6]，也有少數(shù)細(xì)菌[7-8]，而產(chǎn)葡萄糖氧化酶的野生型酵母菌暫未見報(bào)道。提高酶活的方法有菌株誘變、基因定點(diǎn)突變、利用工程菌表達(dá)等[9-10]。霉菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、淀粉酶等其他多種副產(chǎn)物，對(duì)后期的分離純化工作帶來(lái)很大的困難，大大增加了生產(chǎn)成本[11]。酵母相對(duì)于霉菌具有易培養(yǎng)、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢(shì)，有擴(kuò)大生產(chǎn)的潛力[12]。

篩選及改良遺傳性狀獲得新的高產(chǎn)菌株對(duì)提高工業(yè)生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益非常重要[13-15]。朱運(yùn)平等[16]運(yùn)用常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）對(duì)黑曲霉（Aspergillus niger）進(jìn)行誘變使酶活達(dá)到180.74 U/mL。劉曉筱[17]用ARTP處理重組菌，結(jié)合高通量篩選方法，篩選得到產(chǎn)量明顯提高的正向突變株T2，其搖瓶酶活達(dá)到15.8 U/mL，酶活比出發(fā)菌株提高了44%。但目前還未有關(guān)于產(chǎn)葡萄糖氧化酶的酵母菌的誘變研究。

本研究采用海洋源野生酵母菌株擔(dān)子菌（Basidioascus sp.）WYQ 23為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變、化學(xué)誘變及復(fù)合誘變的方法對(duì)其進(jìn)行誘變處理，旨在獲得產(chǎn)活性高、穩(wěn)定性好的低溫葡萄糖氧化酶酵母突變菌株，并通過(guò)對(duì)突變菌株產(chǎn)的低溫葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了潛在的優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

海洋源擔(dān)子菌（Basidioascus sp.）WYQ23：保藏于遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，GenBank號(hào)為SUB4615397 Seq1 MK038973。

1.1.2 化學(xué)試劑

鄰聯(lián)茴香胺（分析純）、硫酸二乙酯（分析純）：美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶（60 U/mL）：生工生物工程（上海）股份有限公司。乙醇（純度95%）、硫代硫酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

顯色篩選固體培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO42g/L，MgSO40.7g/L，KCl 0.5g/L，NaNO34g/L，CaCO33.5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，脫氧膽酸鈉0.2 g/L，海水配制，pH自然，121℃滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，海水配制，pH自然，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨3 g/L，CaCO36 g/L，MgSO40.7 g/L，KCl 0.3 g/L，KH2PO43 g/L，NaNO33 g/L，海水配制，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-100SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HD-1360超凈工作臺(tái)：北京悅泰行科技發(fā)展有限公司；THZ-312臺(tái)式恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精勝科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀：美國(guó)THERMO FISHER公司；pHB-4p酸度計(jì)：上海升隆公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖氧化酶粗酶液的制備

挑取一環(huán)平板上的菌株接種在種子液培養(yǎng)基中，25℃、160 r/min培養(yǎng)24 h后，以1%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、160 r/min培養(yǎng)38 h；將發(fā)酵液4℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液即為粗酶液。

1.3.2 GOD酶活測(cè)定方法

將反應(yīng)體系為5%葡萄糖溶液100 μL、0.07 g/L鄰聯(lián)茴香胺溶液200 μL、0.1 g/L辣根過(guò)氧化物酶溶液10μL的混合溶液與10 μL葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)樣品或粗酶液[18-19]分別于25℃溫育10 min后，將反應(yīng)體系及標(biāo)準(zhǔn)樣品或粗酶液迅速混勻，在波長(zhǎng)500nm處測(cè)其0～5min吸光度值的變化（ΔA），每隔1min測(cè)一次[20-21]。GOD酶活（EAGOD）計(jì)算公式如下：

GOD酶活的定義：在上述實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘催化氧化1 μmol/L的葡萄糖的酶量定義為一個(gè)酶活單位（1 U/mL）。

1.3.3 菌懸液制備

將保藏的海洋擔(dān)子菌（Basidioascus sp.）WYQ 23接種至顯色篩選固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，將活化后的菌接種于種子液培養(yǎng)基中，25℃、160 r/min培養(yǎng)36 h，4 000 r/min離心10 min，得到菌體。用無(wú)菌海水稀釋菌體至104CFU/mL。

1.3.4 產(chǎn)低溫GOD菌株的紫外誘變

吸取10 mL菌懸液于磁力攪拌器上的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌轉(zhuǎn)子不斷攪拌。將紫外誘變儀（紫外線波長(zhǎng)254 nm）置于平板上方18cm處，分別照射2min、4min、6min、8 min、10 min、12 min、14 min、16 min、18 min。以未照射的菌懸液作空白對(duì)照，吸取100 μL不同照射時(shí)間的菌懸液均勻涂布至顯色篩選固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計(jì)誘變前后的菌落數(shù)量變化，計(jì)算致死率，選擇致死率80%～90%的平板挑取顯色圈較大的菌株進(jìn)行純化及發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)其GOD酶活。致死率計(jì)算公式如下：

1.3.5 產(chǎn)低溫GOD菌株的化學(xué)誘變

將1 mL的硫酸二乙酯與0.5 mL的無(wú)水乙醇混合均勻，加入到3.5 mL菌懸液中誘變，分別在5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min加入0.5 mL 25%硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。以加入無(wú)菌海水處理的菌懸液做空白對(duì)照，吸取100 μL不同誘變時(shí)間的菌懸液均勻涂布至顯色篩選固體培養(yǎng)基上，25℃靜置培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計(jì)誘變前后的菌落數(shù)量變化，計(jì)算致死率。選擇致死率80%～90%的平板挑取顯色圈較大的菌株進(jìn)行純化及發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)其GOD酶活。

1.3.6 產(chǎn)低溫GOD菌株的復(fù)合誘變

以方法1.3.4節(jié)中紫外誘變所得產(chǎn)GOD酶活最高的菌株作為出發(fā)菌株，接種于種子液培養(yǎng)基中，25℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，4 000 r/min離心10 min，得到菌體。用無(wú)菌海水稀釋菌體至104CFU/mL。將1 mL的硫酸二乙酯與0.5 mL的無(wú)水乙醇混合均勻，加入3.5 mL菌懸液中誘變，分別在10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min加入0.5 mL 25%硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。以加入無(wú)菌海水處理的菌懸液做空白對(duì)照，吸取100 μL不同誘變時(shí)間的菌懸液均勻涂布至顯色篩選固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)4d，統(tǒng)計(jì)誘變前后的菌落數(shù)量變化，計(jì)算致死率。選擇致死率80%～90%的平板挑取顯色圈較大的菌株進(jìn)行純化及發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)其GOD酶活。

1.3.7 遺傳穩(wěn)定性

將經(jīng)篩選的高產(chǎn)GOD誘變菌株按斜面?zhèn)鞔姆椒ㄟB續(xù)傳代8次，測(cè)量每次傳代菌株的GOD酶活，考察其遺傳穩(wěn)定性。

1.3.8 酶學(xué)性質(zhì)研究

（1）溫度對(duì)酶活的影響

酶的最適溫度：將酶液分別置于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃孵育10 min后測(cè)其GOD酶活。以最高的酶活為100%，計(jì)算各溫度條件下的相對(duì)酶活。

酶的溫度穩(wěn)定性：將酶液分別置于10℃、20℃、30℃、40 ℃、50 ℃孵育15 min、30 min、45 min、60 min后測(cè)其GOD酶活。以各溫度最開始的酶活為100%，計(jì)算孵育后不同時(shí)間條件下相對(duì)酶活。

（2）pH值對(duì)酶活的影響

酶的最適pH：將酶液分別與pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖液1∶1混合，在最適溫度下孵育10 min后測(cè)其GOD酶活。以最高的酶活為100%，計(jì)算各pH條件下的相對(duì)酶活。

酶的pH穩(wěn)定性：將酶液分別與pH值為3.0、4.0、5.0、7.0、8.0的磷酸緩沖液1∶1混合，在最適溫度條件下孵育15 min、30 min、45 min、60 min后測(cè)其酶活。以各pH最開始的酶活為100%，計(jì)算孵育后不同時(shí)間條件下相對(duì)酶活。

（3）金屬離子對(duì)酶活的影響

將酶液分別與0.035 mol/L的Ag+、Zn2+、Mg2+、Na+、Cu2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、K+、Ca2+溶液1∶1混合，在最適溫度條件下孵育10 min后測(cè)其GOD酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變

對(duì)海洋擔(dān)子菌（Basidioascus sp.）WYQ 23進(jìn)行紫外誘變，其紫外照射致死率結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，隨著紫外誘變時(shí)間的增加，致死率也逐漸增大，在照射12 min時(shí)致死率為84.9%。通常情況下致死率在80%～90%時(shí)正突變率較高。因此，選擇12 min為最佳紫外誘變時(shí)間。

圖1 菌株紫外誘變致死率Fig.1 Lethality rate of strains induced by ultraviolet mutation

在紫外誘變12 min對(duì)應(yīng)的平板上篩選得到顯色圈較大的8株菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行，其GOD酶活測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 紫外誘變菌株的葡萄糖氧化酶酶活Table 1 Glucose oxidase activity of strain by UV mutation

由表1可知，紫外誘變后大部分菌株與原始菌株WYQ 23相比，產(chǎn)GOD性能均有所提高，其中菌株編號(hào)為WYQ 23-1-6的GOD酶活最高，為2.25 U/mL。

2.2 化學(xué)誘變

對(duì)海洋擔(dān)子菌（Basidioascus sp.）WYQ 23進(jìn)行化學(xué)誘變，其化學(xué)誘變致死率結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株化學(xué)誘變致死率Fig.2 Lethality rate of strains induced by chemical mutation

由圖2可知，隨著化學(xué)誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率也隨著增加。在化學(xué)誘變25min時(shí)其致死率達(dá)到86.0%。

在致死率86.0%對(duì)應(yīng)的平板上挑取顯色圈較大的8株菌株進(jìn)行純化及發(fā)酵培養(yǎng)，其GOD酶活測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 化學(xué)誘變菌株的葡萄糖氧化酶酶活Table 2 Glucose oxidase activity of strain by chemical mutation

由表2可知，紫外誘變后大部分菌株與原始菌株WYQ 23相比，產(chǎn)GOD性能均有所提高，其中菌株編號(hào)為WYQ 23-2-7的GOD酶活最高，為2.31 U/mL。

2.3 復(fù)合誘變

對(duì)經(jīng)過(guò)紫外誘變的菌株WYQ 23-1-6進(jìn)行化學(xué)誘變，挑取顯色圈較大的8株菌株進(jìn)行純化及發(fā)酵培養(yǎng)，其GOD酶活測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 復(fù)合誘變菌株的葡萄糖氧化酶酶活Table 3 Glucose oxidase activity of strain by compound mutation

由表3可知，復(fù)合誘變后大部分菌株與原始菌株WYQ 23相比，產(chǎn)GOD性能均有所提高，其中菌株編號(hào)為WYQ 23-3-4的GOD酶活最高，為2.33 U/mL。說(shuō)明復(fù)合誘變與紫外、化學(xué)單一誘變相比較，正突變的效果相對(duì)較好。

2.4 遺傳穩(wěn)定性

將誘變之后酶活最高的誘變菌株WYQ 23-3-4進(jìn)行8次傳代培養(yǎng)，每傳一代測(cè)其GOD酶活，結(jié)果如圖3所示。

圖3 菌株WYQ 23-3-4遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of strain WYQ 23-3-4

由圖3可知，誘變株WYQ 23-3-4在1～8代范圍內(nèi)產(chǎn)GOD酶活較穩(wěn)定，均維持在2.33 U/mL左右，說(shuō)明誘變菌株WYQ 23-3-4具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.5 酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 溫度對(duì)酶活影響

葡萄糖氧化酶的最適溫度及及其穩(wěn)定性見圖4。由圖4A可知，葡萄糖氧化酶活力在0～20℃范圍內(nèi)，隨溫度提高而上升；葡萄糖氧化酶活力在20℃時(shí)達(dá)到最高；葡萄糖氧化酶活力在溫度＞20℃之后，隨溫度提高而下降。在0～40℃時(shí)酶活均高于80%。由圖4B可知，當(dāng)溫度為10℃時(shí)其穩(wěn)定性最好，處理1 h后其相對(duì)酶活仍＞85%。在50℃處理1 h，相對(duì)酶活降約80%。

圖4 溫度對(duì)葡萄糖氧化酶酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on glucose oxidase activity

2.5.2 pH值對(duì)酶活影響

葡萄糖氧化酶的最適pH及在20℃不同pH條件下測(cè)定純化后的葡萄糖氧化酶活力，結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對(duì)葡萄糖氧化酶酶活的影響Fig.5 Effect of pH on glucose oxidase activity

由圖5A可知，該酶的最適作用pH值范圍在pH5.0～6.0，最適pH為5.5。由圖5B可知，在pH 5.0處理1 h后其酶活仍保留88%左右。

2.5.3 金屬離子對(duì)酶活的影響

在20℃、pH 5.5條件下在酶液中加入不同種類的金屬離子，測(cè)定純化后的葡萄糖氧化酶活力，結(jié)果見表4。由表4可知，金屬離子Ag+、Zn2+、Fe2+中對(duì)酶活抑制作用較強(qiáng)，其酶活分別下降到原來(lái)的30.07%、36.18%、38.04%；Mg2+、K+對(duì)酶有激活作用，酶活分別提高到原來(lái)的104.31%及115.79%。

表4 金屬離子對(duì)葡萄糖氧化酶酶活的影響Table 4 Effect of metal ions on glucose oxidase activity

3 結(jié)論

利用紫外誘變、化學(xué)誘變及紫外-化學(xué)復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)一株海洋來(lái)源的產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶擔(dān)子菌（Basidioascus sp.）WYQ 23進(jìn)行誘變育種，獲得一株高產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶的突變菌株Basidioascus sp.WYQ 23-3-4。該突變菌株GOD酶活為2.33 U/mL，是原始菌株的1.40倍。經(jīng)8代傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，突變菌株WYQ 23-3-4產(chǎn)葡萄糖氧化酶能力穩(wěn)定。該酶最適溫度為20℃，在10～30℃可保持較高酶活；最適pH值為5.5，在pH5.0～6.0可保持較高酶活；金屬離子Ag+、Zn2+、Fe2+中對(duì)酶活抑制作用較強(qiáng)，Mg2+、K+對(duì)酶有激活作用。綜上，通過(guò)復(fù)合誘變可明顯提高擔(dān)子菌產(chǎn)低溫葡萄糖氧化酶的能力，為對(duì)現(xiàn)有不足的有效解決方法之一。