打頂后煙葉內源生長素含量的變化對綠原酸含量的影響

楊銀菊，王樹聲，劉光亮，曾文龍，陳志厚，戴培剛，李琦瑤，陳愛國*

(1. 中國農業科學院煙草研究所/農業部煙草生物學與加工重點實驗室，山東 青島 266101；2. 中國農業科學院研究生院，北京 100081；3.福建省煙草農業科學研究所龍巖分所，福建 龍巖 364000；4. 福建省煙草農業科學研究所南平分所，福建 南平 353000)

【研究意義】烤煙是以葉片為收獲器官的一種經濟作物，煙株進入生殖生長階段以后，如果不去除生殖器官，營養物質就會大量的流向頂部花序，造成煙葉產量降低、品質下降[1]。因此打頂對提高烤煙的品質和產量極其重要。提高煙葉香氣質量一直是我國烤煙栽培研究的熱點。然而，烤煙香氣組分種類繁多，不可能一一進行研究，因此，有必要針對某一種或幾種特征香氣成分開展合成積累研究。煙草中多酚類物質種類眾多，主要包括綠原酸、蕓香苷、莨菪亭，其中綠原酸含量與改善煙葉等級密切相關[2]。研究表明綠原酸含量在打頂后迅速上升，但其調控機理尚未完全闡明[3-5]，不利于特征風格的彰顯和定向提升煙葉質量。【前人研究進展】打頂與烤煙產量和品質形成密切相關。一方面，打頂可以促進煙株根系生長，有利于養分和水分的吸收及煙堿的合成[6]。另一方面，打頂能協調煙株庫源關系和物質代謝、分配途徑，提高葉片中光合同化物分配比例，改善葉片中香氣物質的含量和協調性，增加中上等煙葉產量[7-8]。此外，打頂對于煙株養分的吸收和分配、煙堿的積累規律及內源激素含量等均會產生影響[9-10]。打頂后煙株內源激素原有的平衡被打破，田效園等[11]研究發現煙葉內源生長素含量在打頂后顯著降低，時向東等[12]報道煙葉中IAA含量在打頂后先升高后降低。【本研究切入點】打頂后綠原酸和內源生長素含量都發生很大的變化，那么打頂后煙葉中綠原酸含量的變化是否與生長素含量動態平衡被打破有關？目前，沒有相關文獻報道。【擬解決的關鍵問題】本研究通過添加外源生長素α-萘乙酸(α-Naphthalene acetic acid，NAA)和生長素極性運輸抑制劑萘草胺(N-1-naphthylphthalamic acid，NPA)處理，利用高效液相色譜法和酶聯免疫法來測定打頂后煙葉IAA含量、綠原酸含量以及綠原酸合成和降解關鍵酶的活性，旨在為探明打頂后煙葉中IAA含量對烤煙綠原酸生物合成的調控機理，從而定向提高煙葉品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種紅花大金元種子由國家煙草種質資源庫提供，種子經浸泡、滅菌、消毒后于 28 ℃黑暗條件下催芽，沙培45 d后進行移栽。盆栽試驗于2016年9月20日至12月29日在中國農業科學院煙草研究所溫室內進行，苗期日平均溫度為(25±1)℃，現蕾到打頂期日平均氣溫(25±1)℃，盆高20 cm，直徑25 cm，每盆裝土8 kg，基質(腐殖酸含量≥5.0 %，有機質含量≥25.0 %)與土(棕壤，有效氮、磷、鉀含量分別為97.29、8.84、216.98 mg/kg)1∶1(v/v)混勻后裝盆，每盆種植1株。

1.2 試驗處理

1.2.1 不同時期打頂對生長素含量和綠原酸含量的影響 分別在苗期(八葉一心期)和現蕾后10 d(移栽后85 d)設置打頂處理、打頂+NAA處理和不打頂處理。每個處理種植25株；苗期打頂處理采用刀片將幼嫩的未展開葉片及以上莖頂端組織切除，打頂+NAA處理在打頂后立即用脫脂棉在莖斷面切口涂20 mmol/L抹萘乙酸；現蕾后打頂處理于50 %第一中心花開放時切除莖頂端(留葉18片)，打頂+NAA處理在打頂后立即用脫脂棉在莖斷面切口涂30 mmol/L抹萘乙酸。

處理后第3、6、9和12天，每處理分別選取3株生長正常一致煙株的中部葉(苗期第4葉位，現蕾后10天第8葉位)，作為3個生物學重復；去除主脈后煙葉置于液氮中速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱中。生長素含量檢測采用打頂后第3、6天的樣品，多酚檢測采用打頂后第3、6、9、12天的樣品。

1.2.2 外源生長素及生長素極性運輸抑制劑處理對綠原酸的影響 在苗期(八葉一心期)設置打頂處理、打頂+NAA處理、未打頂+NPA處理和未打頂處理。每個處理種植15株；打頂處理采用刀片將幼嫩的未展開葉片及以上莖頂端組織切除，打頂+NAA處理在打頂后立即用脫脂棉在莖斷面切口涂20 mmol/L抹萘乙酸。未打頂+NPA處理在煙株頂端噴施80 mmol/L的萘草胺。

處理后第3和6天，每處理分別選取3株生長正常一致的中部葉，作為3個生物學重復；去除主脈后煙葉置于液氮中速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱中。用于生長素、綠原酸含量以及綠原酸合成和降解關鍵酶活性測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 綠原酸含量測定 參照YC/T 202-2006行業標準[13]，用高效液相色譜法(HPLC)測定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含量。

1.3.2 生長素含量測定 參照Wang[14]的方法，利用高效液相色譜法(HPLC)測定IAA含量。

1.3.3 酶活性測定 采用酶聯免疫法法利用PAL、C4H、4CL、C3H、HCT、POD和PPO活性測定試劑盒(江蘇科晶生物技術有限公司)測定苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)、肉桂酸4-羥化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)、對-香豆酸3′-羥化酶(ρ-coumaroylester 3’-hydroxylase，C3H)、羥基肉桂酰輔酶A：莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶(hydroxycinnamoyl CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase，HCT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性。利用酶聯免疫法(江蘇綠葉生物技術有限公司)測定羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶(hydroxycinnamoyl-CoA:quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT)活性。

圖1 不同時期打頂后NAA處理對煙葉綠原酸含量的影響Fig.1 Effects of exogenous NAA applications on the content of chlorogenic acid in tobacco leaves at the different topping stage

1.4 數據處理

采用SAS 9.1軟件進行LSD多重比較法方差分析(P<0.05)，Excel和Origin9.1軟件制作圖表。

2 結果與分析

2.1 不同時期打頂及涂抹NAA處理對煙葉綠原酸含量和內源生長素的影響

2.1.1 不同時期打頂及涂抹NAA處理對煙葉綠原酸含量的影響 由圖1可知，煙葉綠原酸含量在苗期打頂后顯著降低。打頂后3～12 d內，打頂+NAA處理煙葉綠原酸含量呈現先升高后降低的趨勢。其中除第9天以外，打頂處理煙葉中綠原酸含量均顯著低于未打頂處理，而打頂+NAA處理煙葉中綠原酸含量顯著高于打頂處理，升高到了未打頂水平。

由圖1可知，現蕾后打頂煙葉綠原酸含量顯著升高。現蕾后打頂3～12 d內，打頂+NAA處理煙葉綠原酸呈現先降低后增加趨勢。打頂+NAA處理煙葉綠原酸含量在處理后6～12 d均高于打頂處理。在打頂后3 d，與打頂處理相比，打頂+NAA處理煙葉綠原酸含量降低24.9 %。在打頂后第6和9天，打頂+NAA處理煙葉綠原酸含量顯著高于打頂處理。

2.1.2 不同時期打頂及涂抹NAA處理對煙葉內源生長素含量的影響 由圖2可知，苗期打頂后3～6 d時，打頂處理煙葉IAA含量均顯著低于未打頂處理，打頂+NAA處理煙葉IAA含量顯著高于打頂處理，涂抹NAA后第3天時煙葉內源IAA升高幅度較大，處理后第6天時下降到未打頂煙葉的IAA含量水平。現蕾后打頂3～6 d時，打頂處理煙葉IAA含量先升高后降低，在第3天時顯著高于未打頂處理，在第6天時，顯著低于未打頂煙株。打頂+NAA處理煙葉IAA含量在處理期間持續最高。

2.2 打頂后煙葉生長素含量與綠原酸含量間關系驗證

2.2.1 打頂后外源物質處理對內源生長素的影響 由圖3可知，打頂后打頂處理煙葉IAA含量在3～6 d內均顯著低于未打頂處理，打頂煙株葉片IAA含量分別降低21.1 %和7.5 %,打頂后添加NAA處理可以提高IAA含量，而噴施NPA顯著抑制煙葉中IAA的含量,頂后第3和第6天時，與未打頂煙株葉片中IAA含量相比，未打頂+NPA煙葉中IAA含量分別下降59.3 %和52.3 %。

圖2 不同時期打頂對煙葉生長素含量的影響Fig.2 Effects of exogenous NAA applications on the content of auxin in tobacco leaves at the different topping stage

圖3 外源NAA和NPA處理對煙葉內源生長素含量的影響Fig.3 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the content of auxin in tobacco leaves

2.2.2 打頂后外源物質處理對綠原酸含量的影響 由圖4可知，打頂后3～6 d內，打頂處理煙葉綠原酸含量顯著低于未打頂處理，降低8 %左右；打頂+NAA處理綠原酸含量顯著高于打頂處理，分別提高28.9 %和29.2 %；打頂+NPA處理煙葉綠原酸含量最低，顯著低于其他3個處理。

2.2.3 打頂后外源物質處理對綠原酸合成關鍵酶活性的影響 由圖5可知，處理后3～6 d時，與未打頂處理相比，除了打頂后第6天時HQT活性以外，打頂處理煙葉幾種綠原酸合成關鍵酶活性顯著升高。打頂+NAA處理煙葉C3H活性顯著高于打頂處理，其余幾種關鍵酶活性均顯著低于打頂處理。未打頂+NPA處理煙葉除PAL以外，其他幾種關鍵酶活性均顯著高于未打頂處理。

圖4 外源NAA和NPA處理對煙葉綠原酸含量的影響Fig.4 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the content of chlorogenic acid in tobacco leaves

2.2.4 打頂后外源物質處理對綠原酸降解關鍵酶活性的影響 由圖6可知，在打頂后3～6 d，打頂處理煙葉POD活性顯著高于未打頂處理，分別提高56.3 %、25.4 %。打頂+ NAA處理煙葉POD活性顯著低于打頂處理。未打頂+NPA處理煙葉POD活性顯著高于未打頂處理。處理后第3天時，打頂處理煙葉PPO活性顯著高于未打頂處理和打頂+NAA處理，顯著低于未打頂+NPA處理；第6天時打頂處理煙葉PPO活性顯著高于未打頂處理，其余處理間PPO活性差異不顯著。

圖5 外源NAA和NPA處理對煙葉綠原酸合成關鍵酶活性的影響Fig.5 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the activity of key enzymes on the process of chlorogenic acid synthesis in tobacco leaves

圖6 外源NAA和NPA處理對煙葉綠原酸降解關鍵酶活性的影響Fig.6 Effects of exogenous NAA and NPA applications on the activity of key enzymes on the process of chlorogenic acid degradation in tobacco leaves

3 討 論

PAL是苯丙烷代謝途徑的第一個關鍵酶，也是連接初生代謝和次生代謝的關鍵酶，其活性受機械損傷、病原物等外界刺激的誘導[13-14]。因而PAL與植物生長發育、應激防御密切相關。本研究發現打頂后PAL活性增強，與袁衛瑜等[5]研究結果一致。打頂+NAA處理煙葉PAL活性顯著降低于打頂處理，推測涂抹NAA后機械損傷作用可能被削弱了。C4H、4CL、C3H、HCT和HQT均是綠原酸合成過程的關鍵酶[15-18]，與未打頂處理相比，其他幾個處理的這幾個關鍵酶活性均顯著升高，與綠原酸含量變化規律不完全一致，說明綠原酸含量的變化可能與降解有關。PPO是一類能夠將酚類化合物氧化為醌的酶[19]，機械損傷、食草動物啃食、病源物侵染以及環境脅迫，均可誘導植物體內PPO活性升高[20-21]。黃永等[22]研究發現打頂可以提高PPO活性。張婷等[10]的研究也有類似的發現。本研究結果與之相似。

本研究通過添加NAA和NPA探討了打頂后生長素對綠原酸的調控作用。結果表明打頂后涂抹NAA煙株葉片生長素含量升高，綠原酸含量也升高，而涂抹NPA的煙株葉片生長素含量降低，綠原酸含量也降低。說明打頂后煙葉生長素含量與綠原酸含量變化存在相關關系。時向東等[12]研究表明打頂后雪茄皮外包煙葉片中內源IAA含量在打頂呈現下降的趨勢，本研究結果與之一致。Shi 等[23]研究也表明打頂后內源IAA含量降低。本研究發現打頂處理和NPA處理煙葉中內源IAA和綠原酸含量降低，而POD和PPO活性升高；打頂+NAA處理煙葉中內源IAA和綠原酸含量升高，POD和PPO活性降低。說明打頂后綠原酸降解速率大于合成速率，并受生長素調控。研究表明，IAA能顯著降低PPO活性，促進酚類物質合成積累[24]。這與同一時期IAA濃度較高則綠原酸含量較高的規律一致。綜上，打頂誘導綠原酸生物合成與打頂后內源生長素含量的的變化密切相關。

4 結 論

本研究采用高效液相色譜法和酶聯免疫法，對不同處理的煙草葉片中3種綠原酸的同分異構體含量、IAA含量以及綠原酸合成和降解的關鍵酶活性進行分析，主要結論如下。

打頂處理和NPA處理煙葉中內源IAA含量降低，POD和PPO活性升高，綠原酸含量降低；打頂+NAA處理煙葉中內源IAA含量升高，POD和PPO活性降低，綠原酸活性升高。與未打頂處理相比， PAL、C4H、4CL、C3H和HQT活性在不同處理條件下均升高，說明打頂或NPA處理后綠原酸降解速率強于合成合成速率，打頂+NAA處理通過添加外源生長素減弱打頂的效應，綠原酸合成速率強于降解速率，不同處理條件下綠原酸含量的變化與POD、PPO活性變化密切相關。綜上，打頂后內源生長素含量的變化與打頂調控綠原酸生物合成密切相關。