泛素E3連接酶TRIM10在心肌細胞缺氧/復氧損傷的作用及機制

劉 洋 陳東 侯翠柳 來松 楊 慧 肖雪 王筱筱 田 翠 王紅霞

缺血性心臟病是世界范圍的最主要死因［1］，而再灌注損傷是缺血性心臟病發生最主要的原因，如何保護心臟對抗再灌注損傷對心臟病學家來說是一種挑戰。心肌缺血-再灌注損傷是指心肌組織在缺血基礎上恢復血流后組織損傷沒有減輕反而加重甚至發生不可逆性損傷的現象。雖然心肌缺血-再灌注的機制尚未完全被闡明，目前的研究認為心肌細胞的凋亡為再灌注損傷發病機制中的一個重要環節［2］。細胞凋亡是指由體內外因素觸發細胞內預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程［3］。研究已證實凋亡可以由特異的泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）來調控，其介導的凋亡在心力衰竭、缺血-再灌注損傷等心血管疾病中，起著關鍵性作用［4-5］。

UPS系統由泛素、泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素-蛋白連接酶E3、26S蛋白酶體和去泛素化酶等組成［6］。真核生物體內，80%～90%的蛋白被UPS系統特異性識別降解。UPS不僅是蛋白質降解的重要機制，還參與炎癥、細胞增殖與分化、信號轉導、轉錄調控、受體胞吞、免疫應答、細胞凋亡等重要生命過程的調節［7-8］。其中，泛素E3連接酶（如CHIP、MDM2等）負責特異性識別底物蛋白，參與心肌缺血-再灌注損傷的發生。

TRIM家族是一個近年來發現并且受到重視的含RING結構域的E3連接酶。目前發現的TRIM家族蛋白有60多種［9］，參與調控凋亡、細胞周期、分化、細胞對病毒的反應等諸多重要的生命過程。例如MID1基因的突變會導致先天性的Opitz綜合征［10］、TRIM25可誘導視黃酸誘導型基因-I的泛素化，對引發宿主抗病毒先天免疫至關重要［11］；TRIM59可通過調節細胞周期的進程促進前列腺癌的細胞增殖等［12］。TRIM10是TRIM家族的成員之一，同樣具有E3連接酶的功能，主要參與紅系細胞的終末分化，對造血功能、細胞凋亡均具有重要的調節作用［13］。本實驗室前期研究發現TRIM10參與了心肌肥大的發生［14］，但是TRIM10在心肌細胞缺氧/復氧損傷中的作用尚不清楚。

本實驗在原代培養的心肌細胞中，轉染siRNATRIM10敲低和轉染Ad-TRIM10過表達TRIM10，復制心肌細胞H/R模型（缺氧30 min，復氧24 h），觀察心肌細胞氧化應激、細胞凋亡以及相應蛋白表達的情況，探討TRIM10在心肌細胞缺氧/復氧損傷中的作用及其機制。

材料與方法

1.實驗動物 SD大鼠，新生乳鼠（出生24 h之內）由北京維通利華有限公司提供。所有研究工作均遵守美國國立衛生研究院（NationalInstitutesof-Health，NIH）制定的《實驗動物管理及使用指南》并經首都醫科大學實驗動物管理委員會批準。

2.主要試劑及儀器 TUNEL、DHE染色試劑盒購自瑞士Roche公司；過表達腺病毒Ad-TRIM10和Ad-GFP由漢恒生物公司合成；siRNA-TRIM10、siRNA-Scramble由中原生物有限公司合成。Lipofectamine 2000購自Invitrogen；DMEM/F12培養基和胎牛血清購自Gibco；TRIM10、GAPDH、BAX、p-JNK/JNK、p-P38/P38、p-ERK/ERK抗體及兔源II抗購于美國Cell Signaling Technology公司。

3.主要方法 （1）原代心肌細胞培養及轉染:提取SD大鼠乳鼠心肌細胞，放入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養基中貼壁培養24 h，饑餓6～8 h后，轉 染Ad-TRIM10和Ad-GFP（50 nmol/L，1∶1 000）過表達內源性TRIM10或用Lipofectamine 2000轉 染siRNA-TRIM10和siRNA-Scramble（20 nmol/L，1∶1 000）敲低內源性TRIM10表達。48 h后，給予缺血Buffer處理30 min，再將細胞培養液更換為含有ITS、CDlipid及10%BSA無血清的DMEM/F12培養基繼續培養細胞24 h收取細胞用于后續實驗。

（2）細胞TUNEL染色 4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS洗3 min，3次，0.1%Tritonx-100室溫封閉通透15 min，PBS洗3 min，3次，加入羅氏TUNEL染色試劑，37℃避光孵育60 min，PBS洗3 min，3次，抗熒光淬滅劑封片。用Nikon Labophot 2顯微鏡進行采圖（×200），選擇6～8個視野，應用Image J軟件統計每個視野細胞核數目及凋亡細胞數，凋亡細胞占總細胞數的比值即為凋亡百分數。

（3）細胞DHE染色 用4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS洗3 min，3次，室溫封閉通透15 min，PBS洗3 min，3次，DHE工作液滴染，37℃避光孵育30 min，PBS洗3 min，3次，抗熒光淬滅劑封片。用Nikon Labophot 2顯微鏡進行采圖（×200），選擇6～8個視野，應用Image J軟件統計每個視野細胞核數目及發生氧化應激的細胞數，氧化應激細胞占總細胞數的比值即為氧化應激百分數。

（4）Western blot實驗 用蛋白RIPA（PMSF∶RIPA=1∶100）裂解液120μL冰上裂解細胞15 min，用細胞刮刀收取至1.5 mL EP管中，細胞破碎儀裂解細胞后離心（4℃、12 000 r/min）10 min，吸取上清，BCA法測蛋白濃度，取40～50μg總蛋白進行SDS-PAGE，然后將蛋白電轉至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，I抗4℃孵育過夜，次日洗滌10 min，3次。用II抗孵育膜1 h，洗滌15 min，4次，ECL顯影。

4統計學方法 統計分析使用SPSS19.0軟件進行。每個指標進行3次以上獨立重復實驗，所得計量數據均以均數±標準誤表示，均數組間比較采用單因素方差分析方法.以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.H/R處理上調心肌細胞TRIM10蛋白表達H/R處理對TRIM10蛋白表達的變化。結果顯示:與對照組相比，H/R處理后6 h或24 h上調心肌細胞中TRIM10蛋白的表達，且在24 h差異有統計學意義（圖1）。

2.敲低TRIM10減輕H/R誘導ROS的產生、而其過表達則加重以上變化 首先我們檢測siRNATRIM10和Ad-TRIM10轉染的效率，結果顯示:siRNA-TRIM10明顯下調TRIM10的表達（下降了60%，圖2 A），而Ad-TRIM10轉染效率為90%（圖2B）；進一步觀察敲低或過表達TRIM10對H/R誘導的心肌細胞中ROS產生的影響，結果發現敲低TRIM10明顯減少H/R誘導的ROS的產生（圖2C），而過表達TRIM10進一步增加H/R誘導的ROS的產生（圖2D）。

3.敲低TRIM10減輕H/R誘導的心肌細胞凋亡并下調BAX蛋白的表達、而其過表達則加重以上變化 與Control組相比，H/R明顯增加TUNEL染色陽性細胞數，敲低TRIM10減輕H/R誘導的細胞凋亡（圖3 A）；而過表達TRIM10則加重H/R誘導的細胞凋亡（圖3C）。進一步我們檢測了促凋亡蛋白BAX的表達，結果顯示:與Control組相比，H/R組明顯上調心肌細胞BAX蛋白的表達，敲低TRIM10下調H/R誘導的BAX蛋白表達（圖3B）、而過表達TRIM10則加重了以上變化（圖3D）。

4.敲低TRIM10減輕H/R處理誘導的JNK和P38MAPK蛋白的磷酸化水平，而對ERK蛋白的磷酸化水平無影響 與Control組相比，H/R明顯增加JNK、P38MAPK、ERK蛋白的磷酸化；而敲低TRIM10減輕H/R誘導的P38MAPK、JNK蛋白的磷酸化，而對ERK的磷酸化水平無影響（圖4）。

5.過表達TRIM10增加H/R處理誘導的JNK和P38MAPK蛋白的磷酸化水平，而對ERK蛋白的磷酸化水平無影響 與Control組相比，H/R明顯增加JNK、P38MAPK、ERK蛋白的磷酸化；而過表達TRIM10增加H/R誘導的JNK、P38MAPK蛋白的磷酸化，而對ERK的磷酸化水平無影響（圖5）。

討 論

圖1 原代SD大鼠乳鼠心肌細胞不同時間培養后TRIM10蛋白的表達（n=5）

圖2 敲低或過表達TRIM10對H/R誘導的ROS產生的影響 A:原代SD鼠乳鼠心肌細胞培養24 h TRIM10蛋白的表達，B:原代SD大鼠乳鼠心肌細胞培養24 h，熒光顯微鏡觀察綠色細胞陽性數， C-D:DHE染色檢測細胞氧化應激情況（n=5）。注:與對照組比較，*P＜0.05；與H/R組比較，#P＜0.05

本實驗研究發現缺氧/復氧（H/R）損傷增加心肌細胞中TRIM10蛋白的表達，提示TRIM10參與心肌缺氧/復氧損傷的發生。敲低TRIM10減輕H/R誘導的氧化應激和細胞凋亡的發生，并下調BAX蛋白的表達。而過表達TRIM10，加重H/R誘導以上的改變。進一步我們又探討了TRIM10參與以上作用的機制，發現敲低TRIM10明顯降低了H/R誘導的心肌細胞中p-JNK和p-P38MAPK的水平，而對p-ERK的表達無影響，提示TRIM10可能通過激活JNK/P38MAPK通路來誘導細胞凋亡的發生進而加重心肌細胞缺氧/復氧損傷。

圖3 敲低或過表達TRIM10對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響 A:TUNEL染色檢測敲低TRIM10對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響（n=5），B:WB檢測敲低TRIM10對H/R誘導的促凋亡蛋白BAX表達的影響（n=5），C:TUNEL染色檢測過表達TRIM10對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響（n=5），D:WB檢測過表達TRIM10對H/R誘導的促凋亡蛋白BAX表達的影響（n=5）。注:與對照組比較，*P＜0.05；與H/R組比較，#P＜0.05

圖4 敲低TRIM10對H/R誘導的JNK、P38MAPK、ERK蛋白磷酸化水平的影響（n=5） 注:與對照組比較，*P＜0.05；與H/R組比較，#P＜0.05

圖5 過表達TRIM10對H/R誘導的JNK、P38MAPK、ERK蛋白磷酸化水平的影響（n=5） 注:與對照組比較，*P＜0.05；與H/R組比較，#P＜0.05

文獻報道TRIM家族在調節細胞增殖、分化、個體發育、腫瘤及細胞凋亡等多種生物學過程發揮重 要的作用。比如TRIM45可與膜轉運家族蛋白SLC25A3以及熱休克家族蛋白DNAJB6發生相互作用，通過阻斷鈣調磷酸酶介導心肌肥厚的發生。肌肉特異性TRIM家族蛋白MG53是心臟缺血預處理（ischemic preconditioning，IPC）的組成部分，MG53表達下調可加重心肌缺血-再灌注損傷并取消IPC保護作用，而過表達MG53可減弱缺氧和H2O2誘導的心肌細胞死亡，其作用機制為MG53依賴的caveolin-3與磷脂酰肌醇3激酶的相互作用和隨后再灌注損傷補救激酶通路的激活［15］。TRIM10為TRIM家族成員之一，具有TRIM家族所共有的結構域，具有E3連接酶的結構和功能。研究表明TRIM10可調節胚胎發育、紅系細胞生成以及成年小鼠的紅細胞分化與增殖。本研究發現敲低TRIM10可減少H/R誘導的ROS的產生和心肌細胞的凋亡，而過表達則加重以上改變，說明TRIM10參與了心肌細胞缺氧/復氧的發生。

近些年研究發現細胞凋亡是心肌發生缺血-再灌注損傷重要的環節之一［16］，而絲裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號途徑介到了心肌凋亡的發生。MAPKs存在于所有生物體內的大多數細胞內，是真核生物細胞重要的信號轉導通路，與細胞的增殖、存活、分化和凋亡等密切相關。其主要家族成員主要包括ERKs，JNKs和p38MAPKs。目前的研究證實P38、JNK的激活參與了心肌細胞促凋亡的過程［17］。Kasier等的研究發現，p38MAPK的激活或過度表達p38MAPK基因均使缺血-再灌注引起的心肌細胞凋亡明顯增加，心功能降低［18］。抑制JNK活性后能夠保護心肌損傷，減小心梗面積和細胞凋亡［19］。本實驗研究發現敲低TRIM10可減輕H/R誘導的P38MAPK、JNK蛋白的磷酸化水平，提示TRIM10可能是通過激活P38MAPK和JNK信號轉導通路誘導細胞凋亡從而促進心肌細胞缺氧/復氧損傷的發生。

總之，本實驗研究發現泛素E3連接酶TRIM10可加重H/R誘導的心肌細胞氧化應激、細胞凋亡進而參與心肌細胞缺氧/復氧損傷的發生，其機制可能為通過激活P38MAPK和JNK通路所介導，但是仍需要在基因敲除和過表達小鼠模型中進一步驗證TRIM10的作用及其靶分子。