應用CRISPR/Cas9技術制備阿爾茨海默病小鼠模型

陳曉娟 李巍 張旭亮

(浙江大學實驗動物中心，浙江 杭州 310058)

阿爾茨海默病(AD)是一種以認知功能進行性下降和情感障礙為特點的神經退行性疾病〔1〕，發病率呈逐年上升趨勢。AD的臨床特征主要表現為進行性記憶力減退、認知功能下降、語言障礙、精神行為異常等神經精神癥狀〔2〕。α7煙堿型膽堿能受體(α7nAChR)是乙酰膽堿調控的配體門控離子通道蛋白，由5個α7亞基構成的同型五聚體，每個亞基由502個氨基酸組成。α7nAChR主要分布在海馬、皮層等與記憶和認知相關區域〔3〕，對鈣離子有相當高的通透性，能調節鈣的濃度及乙酰膽堿遞質的釋放〔4〕。α7nAChR與認知、記憶、疼痛、神經保護和炎癥密切相關，被認為是潛在的治療AD、帕金森病和炎癥性疾病的作用靶點〔5～7〕。 本研究利用最新的基因修飾技術——CRISPR/Cas9系統〔8〕制備了α7nAChR基因敲除小鼠，為進一步系統研究α7nAChR的功能提供動物模型，并為探索α7nAChR在AD等神經退行性疾病發病機制中的作用積累必要的實驗基礎。

1 材料和方法

1.1實驗動物 SPF級C57BL/6和ICR小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠飼養在浙江大學實驗動物中心屏障環境，12/12 h明暗交替，室溫22～26℃，濕度40%～60%。動物實驗相關操作符合浙江大學動物倫理委員會的規定。

1.2主要試劑 pGL3-U6-sgRNA和Cas9表達載體均由浙江大學轉基因平臺提供；T克隆試劑盒、T4連接酶、Bsa I酶購自takara公司，DNA標記(Marker)購自Thermo公司；PCR mix購自北京全式金生物技術有限公司；引物合成、基因測序均由上海生物工程公司完成。

1.3sgRNA靶點的選擇及sgRNA、Cas9體外轉錄 Chrnα7基因位于7號染色體，蛋白編碼502個氨基酸，共有10個外顯子。應用http：//crispr.mit.edu網站與文獻〔9〕進行分析，針對α7nAChR基因內顯子(intron)3和intron4設計兩條sgRNA(見圖1)，引導Cas9核酸酶定點發生剪切，外顯子(exon)4片段敲除，導致基因讀碼框發生移碼突變，引發無義介導mRNA降解(NMD)效應，最終使蛋白功能缺失。經活性檢測，確定序列為sgRNA1 (5′-3′)：CCATGACCACATTTGTATGA和sgRNA2 (5′-3′)：TGGTATTTGCATCGAAGTTC。

圖1 sgRNA序列設計示意圖

1.4顯微注射及其受精卵移植 將Cas9 mRNA和α7nAChR sgRNA混合后，顯微注射到原核清晰的C57受精卵中，再將胚胎移植入供體ICR母鼠輸卵管內。

1.5F0代敲除小鼠基因型鑒定及擴群繁育 對F0代小鼠的基因型進行鑒定，PCR反應的引物：上游引物GGCTAGAAGTAACCAGTCCAT，下游引物CTGCTTCAAGAGTGCTTCATAT。將鑒定結果敲除陽性的F0代小鼠與C57BL/6J小鼠回交，獲得穩定遺傳的F1代雜合子。再通過F1自交，將獲得F2代進行基因型鑒定后，選出α7nAChR基因敲除純合子擴群繁殖后，進行后續的行為學測試。

1.6小鼠行為學測試 3月齡α7nAChR敲除(KO)雄鼠13只和野生型(WT)雄鼠12只，進行焦慮樣行為和學習記憶能力分析，共4個行為學測試項目。曠場試驗主要測試小鼠的焦慮程度和自主活動能力，對活動距離、活動速度和中心區域活動時間進行分析。高架十字迷宮試驗利用動物對新環境的探索性和對高懸開臂的恐懼，測試動物在復雜環境中的自主活動能力和焦慮程度。動物進入開臂的次數和在開臂滯留時間越長，說明動物的自主活動能力越高，而焦慮程度越低。水迷宮試驗包括定向航行實驗及空間探索實驗。條件性恐懼反射系統是基于巴普洛夫條件反射而建立的一種經典的誘導焦慮反應模型的方法。動物在恐懼時會表現出特有的僵直不動狀態(Freezing)，僵直時間百分比越高，表示越焦慮。

1.7統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、重復測量方差分析。

2 結 果

2.1sgRNA和Cas9體外轉錄結果 根據α7nAChR基因intron3和intron4靶序列信息設計sgRNA，結果顯示，體外轉錄sgRNA和Cas9成功，電泳圖見圖2。

圖2 體外轉錄sgRNA和Cas9電泳結果

2.2F0代小鼠基因型鑒定及擴群繁育 陽性F0代小鼠α7nAChR基因在第四exon有531 bp片段敲除，見圖3。選取陽性F0代小鼠與WT C57BL/6J小鼠回交，獲得穩定遺傳的F1代雜合子，F1自交獲得F2代小鼠的PCR產物進行基因型鑒定，PCR鑒定電泳圖見圖4。根據結果選取 α7nAChR KO純合子進行擴繁。

2.3行為學測試結果

2.3.1曠場試驗 KO組與WT組運動距離、運動速度、中心區域活動時間差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖3 F0代陽性小鼠基因序列突變

1:純合子；2:純合子；3:雜合子；4:雜合子；5:野生型；6:野生型；7:DNA marker 圖4 F2小鼠基因鑒定電泳

表1 曠場實驗測試結果

2.3.2高架十字迷宮試驗 KO小鼠進入開臂的時間〔(45.24±6.63)s〕少于WT小鼠〔(53.63±7.94)s〕，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3.3水迷宮試驗 KO組與WT組在定向航行實驗和空間探索實驗無統計學差異(P>0.05)，見表2。

表2 水迷宮測試結果

2.3.4條件性恐懼反射系統試驗 KO組僵直時間百分比高于WT組，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 條件性恐懼記憶測試結果

3 討 論

AD主要病理特征是神經元外周β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積引發的炎性斑點〔10〕。研究證實，AD患者膽堿能神經元明顯減少，且α7nAChR在大腦皮質和海馬部位顯著下降。Aβ拮抗α7nAChR引起的細胞毒性可以用α7nAChR激動劑緩解〔11〕。臨床試驗證明，α7nAChR激動劑能改善AD患者的認知障礙、學習記憶能力〔12〕。AD的病因及其致病機制尚不明確，利用最新的基因修飾技術，在活體上研究某一特定相關基因的作用，可為AD研究提供理想的動物模型。

本研究采用CRISPR/Cas9技術，利用非同源重組修復引入突變的方式，敲除α7nAChR基因第四exon 531 bp片段，成功構建α7nAChR基因敲除小鼠，為α7nAChR的研究奠定了基礎，為α7nAChR在AD疾病中的作為提供了小鼠模型。83只F0代中僅獲得了1雄1雌2只基因敲除小鼠，雌鼠因與WT雄鼠回交未產仔而淘汰；雄鼠與WT雌鼠交配獲得實驗所需的F1代雜合子。分析本研究中敲除效率低的可能原因有α7nAChR sgRNA和Cas9 mRNA的濃度比例未優化，顯微注射不熟練導致的RNA降解等。

年齡的增長是AD最大的風險因素，大腦的結構和功能會隨著年齡增長發生變化，但AD導致衰老還是衰老導致AD依然存在爭執〔13〕。膜片鉗電生理技術研究發現，與同齡的WT小鼠相比，22～24月齡AD模型鼠在海馬CA3～CA1區域顯著降低了突觸傳遞和長時程增強(LTP)受損〔14〕。小鼠的壽命1～3年，一般雄鼠45～60日齡性成熟，體成熟為70～80日齡〔15〕，24月齡可認為是老年鼠。成年敲除動物是否已出現AD尚無報道。根據C57BL/6J小鼠特性和神經退行性疾病行為學測試一般方法〔16，17〕，本研究選取了3月齡的成年α7nAChR KO雄鼠進行行為學實驗，驗證未衰老的α7nAChR KO鼠有無AD表征。行為學測試結果顯示，α7nAChR KO鼠學習記憶能力正常，但表現出開臂區活動時間短和恐懼時僵直時間比高等焦慮樣行為趨勢，從而推測，AD可能于成年時已經表現出部分病癥。具體出現的時間，有待后續實驗研究發現。